ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay
Summary
בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.
Abstract
חלופי splicing (AS) מתרחשת אצל יותר מ-90% של גנים אנושיים. למשמעות הביטוי אקסון spliced לחילופין מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. כביטוי דפוסי מנותחים בדרך כלל על ידי RT-PCR ו- RNA-seq באמצעות דגימות RNA מבודדים מתוך אוכלוסיה של תאים. בחיי עיר בחינת כמו דפוסי ביטוי עבור מבנה ביולוגי מסוים יכול להתבצע על ידי RNA בחיי עיר הכלאה (איש) משתמש ספציפי אקסון הגששים. עם זאת, השימוש המסויים איש הוגבלה בגלל exons חלופית הם בדרך כלל קצרים מדי בשביל עיצוב ספציפי אקסון הגששים. בדו ח זה, השימוש BaseScope, טכנולוגיה פיתחה לאחרונה מעסיקה oligonucleotides antisense קצר ב- RNA איש, מתואר לנתח כמו דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. אקסון 23a של נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (Nf1) משמש דוגמא כדי להמחיש כי אקסון קצר-אקסון צומת הגששים להפגין אותות חזקים הכלאה עם ירידה לפרטים גבוה בניתוח RNA איש על חלקים במוח העכבר. חשוב מכך, אותות מזוהה עם הגששים הכללה דילוג ספציפיים או אקסון יכול לשמש באופן אמין לחשב את אחוז משולבים בערכים Nf1 אקסון 23a הביטוי תחומים אנטומיים שונים של מוח העכבר. נסיוני ואת שיטת חישוב עבור כמו ניתוח מוצגים. התוצאות מצביעות על כי BaseScope מספק כלי חדש חזק כדי להעריך בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.
Introduction
חלופי splicing (AS) הוא תהליך נפוץ המתרחשת במהלך ההבשלה pre-mRNA. בתהליך זה, אקסון ניתן לכלול באופן שונה ב- mRNA בוגר. לכן, דרך AS, אחד הגנים ניתן להפיק רבות mRNAs את הקוד עבור מוצרי חלבונים שונים. ההערכה היא כי 92-94% של גנים אנושיים לעבור חלופי splicing1,2. חלופה חריג שחבור דפוסי נבעה מוטציות גנטיות נקשרו למספר רב של מחלות, כולל נוירודגנרטיביות, ניוון חולים myotonic וסרטן3,4. לפיכך חיוני לחקור ולהבין טוב יותר מנגנונים רגולטוריים splicing חלופיים, בניסיון למצוא טיפולים חדשים של מחלות אנושיות.
כפי מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. חשוב לקבוע הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים במערכת הביולוגית נתון. עם זאת, זה הופך מסובך כאשר איבר מורכב המכיל סוגים רבים ושונים של תאים, כמו במוח או בלב, הוא למד. במקרה זה, הוא הבחירה האידיאלית של מערכת assay RNA בחיי עיר הכלאה (איש) באמצעות רקמות סעיפים אז הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים ניתן להבחין סוגי תאים רבים בו זמנית. אכן, אקסון ספציפיים הגששים שימשו להערכת רמות הביטוי של6,5,חלופי אקסון7. עם זאת, גישה זו אינה מתאימה עבור כמו ניתוח דפוס מהסיבות הבאות. שיטות איש הראשון, המקובלת בדרך כלל להשתמש יותר מ 300 הגששים bp, בעוד הגודל הממוצע של חוליות exons פנימי (אקסון לא הראשון או האחרון) הוא 170 נוקלאוטידים8,9. שנית, בעת בדיקה ספציפית אקסון לבחון את התבנית splicing של אקסון חלופי פנימי, isoform mRNA היחיד שזיהה את המכשיר הוא אחד המכיל את אקסון, תוך isoform mRNA בלי אקסון לא ניתן לאתרם. לפיכך, חישוב האחוזים משולבים (PSI) ערך עבור אקסון חלופי הוא מסובך. יתר על כן, איש פלורסנט קונבנציונלי משלבת לעיתים קרובות איש עם immunostaining, אשר מפחית את יעילות הזיהוי ואת החוסן. לדוגמה, במחקר שחקרה את מפגינות שחבור isoform מיתוג של אצטילכולין אסטראז (AChE) mRNA, digoxigenin סופחה החללית איש וזוהה באמצעות נוגדן anti-digoxigenin. לחלופין, בדיקה התווית על-ידי ביוטין זוהה על ידי המספר המשלים של phosphatase אלקליין/streptavidin מצע phosphatase אלקליין10. אף שיטה משתמשת בכל אסטרטגיה הגברה כדי להגביר את הרגישות של זיהוי. כתוצאה מכך, זה מאתגר כדי לזהות תעתיקים mRNA באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. לפיכך, מערכת assay איש פשוט יותר ועוצמתי יותר יש צורך לנתח בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.
BaseScope לאחרונה פותחה על הפלטפורמה של RNAscope, ומבוססת בסיס, בשימוש נרחב מערכת assay איש. שתי מערכות assay מעסיקים טכנולוגיה במטרה ההגברה מגביר את הרגישות של זיהוי11,12. מה שמבדיל את אחד מהשני הוא האורך של רצף המטרה, אשר הוא קצר ככל נוקלאוטידים 50 עבור BaseScope, 300-1000 נוקלאוטידים עבור RNAscope. לכן ניתן הגששים עיצוב שכוונו אקסון-אקסון צמתי כדי לזהות איזופורמים mRNA חלופיים ספציפיים. במחקר הנוכחי, הליך הוקמה כדי לבחון ההקלדה דפוסי ביטוי של נוירופיברומטוזיס 1 (Nf1) אקסון 23a, אקסון חלופי בהרחבה למד באותה מעבדה13,14,15 , 16 , 17, בסעיפים מוח העכבר. התוצאות מדגימים כי BaseScope הינה מערכת אידיאלי ללמוד דפוסי ביטוי של אקסון 23a Nf1 באתרו בתוך. מערכת זו assay יכול להיות מותאם כדי לנתח כמו דפוסי ביטוי של exons אלטרנטיביים רבים, הוא מייצג כלי רב עוצמה חדשה בלימודי בשם
Protocol
Representative Results
Discussion
תקשורת זו מדווחת על השימוש BaseScope איש RNA לבדוק דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. הוכח שבצומת הזה תחושה אנטי אקסון-אקסון רגשים קצרים יותר נוקלאוטידים 50 ניתן לייעד אקסון הכללה ולהקפיץ איזופורמים robustly, במיוחד. יתר על כן, האותות וכתוצאה מכך יכול לשמש כדי לחשב PSI של אקסון חלופית.
כמה ו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני [מענק הסיוע 0365274B כדי מרגשת], מכון הסרטן הלאומי [GI נבג P50CA150964 ל ז. ו.], מכוני הבריאות הלאומיים [Office של מחקר תשתית משותפת מכשור גרנט S10RR031845 כדי מיקרוסקופ אור הדמיה המתקן ב אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב], סין מלגת המועצה [עד X.G.].
המחברים תודה ריצ’רד לי אור מיקרוסקופ הדמיה הליבה על עזרתו עם מגלשה סריקה.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
