Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec
Summary
Un protocole in situ (ISH) de l’hybridation qui utilise courts oligonucléotides antisens pour détecter les modes épissage alternatif pré-ARNm dans les sections de cerveau de souris est décrite.
Abstract
Épissage alternatif (AS) se produit dans plus de 90 % des gènes humains. Le modèle d’expression d’un exon épissé alternativement est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. COMME expression patterns sont généralement analysés par RT-PCR et RNA-seq en utilisant des échantillons d’ARN isolé d’une population de cellules. In situ examen de comme modèles d’expression d’une structure biologique particulière peut être effectué par RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de sondes spécifiques exon. Toutefois, cet usage particulier de l’ISH a été limité, car l’alternatives exons sont généralement trop courtes pour la conception des sondes spécifiques exon. Dans ce rapport, l’utilisation de BaseScope, une technologie récemment développée qui emploie courts oligonucléotides antisens dans RNA ISH, est décrite pour analyser comme modèles d’expression dans les sections de cerveau de souris. Exon 23 a de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) est utilisé comme un exemple pour illustrer que sondes jonction exon-exon courte pièce signaux d’hybridation robuste avec une spécificité élevée dans l’analyse des ARN ISH sur des coupes de cerveau de souris. Plus important encore, signaux détectés avec des sondes spécifiques inclusion et sautant exon peuvent servir à calculer fiablement le pourcentage épissé dans les valeurs de Nf1 exon 23 a expression dans différentes zones anatomiques d’un cerveau de souris. Le protocole expérimental et la méthode de calcul pour analyse sont présentés. Les résultats indiquent que BaseScope fournit un nouvel outil puissant pour évaluer en tant qu’expression patterns in situ.
Introduction
Épissage alternatif (AS) est un processus commun qui se produit au cours de la maturation de l’ARN pré-messager. Dans ce processus, un exon peut figurer différemment dans l’ARNm mature. Ainsi, par le biais de AS, un gène peut générer plusieurs ARNm ce code pour produits protéiques différents. Il est estimé que 92 à 94 % des gènes humains subissent une variante épissage1,2. Épissage des patrons d’anormale alternatif résulte de mutations génétiques ont été liées à un grand nombre de maladies, y compris la sclérose latérale amyotrophique, la dystrophie myotonique et cancer3,4. Il est donc crucial d’enquêter et de mieux comprendre les mécanismes de régulation épissage alternatifs pour tenter de trouver de nouveaux traitements des maladies humaines.
COMME est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. Il est important de déterminer le modèle AS d’expression d’un gène spécifique dans un système biologique donné. Toutefois, cela se complique quand un organe complexe qui contient de nombreux types de cellules, comme le cerveau ou le cœur, est étudié. Dans ce cas, un choix idéal de système de dosage est RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de tissus des sections pour le modèle AS d’expression d’un gène spécifique peut être détecté dans de nombreux types de cellules en même temps. En effet, des sondes exon-spécifiques ont été utilisés pour évaluer le niveau d’expression d’un autre exon5,6,7. Toutefois, cette approche n’est pas bien adaptée pour que l’analyse des habitudes pour les raisons suivantes. Tout d’abord, les classiques méthodes ISH utilisent généralement des sondes de plus de 300 bp, alors que la taille moyenne des vertébrés exons internes (pas premier ou le dernier exon) est 170 nucléotides8,9. Deuxièmement, lorsqu’une sonde exon spécifique est utilisée pour examiner le modèle d’épissage d’un exon alternatif interne, l’isoforme d’ARNm uniquement détecté par la sonde est celle qui contient l’exon, tandis que l’isoforme ARNm sans l’exon ne peuvent pas être détecté. Ainsi, le calcul du pourcentage épissé en valeur (lb/po2) pour l’autre exon est compliqué. En outre, ISH fluorescent conventionnel combine souvent ISH immunomarquage, ce qui réduit l’efficacité de la détection et la robustesse. Par exemple, dans une étude qui a enquêté sur le stress induit par l’épissage isoforme de commutation de l’acétylcholinestérase (AChE) mRNA, digoxigénine fut incorporée à la sonde de l’ISH et détectés en utilisant des anticorps anti-digoxigénine. Par ailleurs, sonde marquée à la biotine a été détectée par un conjugué à la phosphatase alcaline/streptavidine et un substrat de la phosphatase alcaline10. Aucune méthode utilise toute stratégie d’amplification pour augmenter la sensibilité de détection. En conséquence, il est difficile de détecter des transcriptions d’ARNm qui sont expriment à de faibles niveaux. Ainsi, un système de dosage ISH plus simple et plus robuste est nécessaire pour analyser comme expression patterns in situ.
BaseScope a été récemment développé basé sur la plate-forme de RNAscope, un bien établi et largement utilisé le système d’essai ISH. Les deux systèmes de dosage emploient une technologie d’amplification spécifique à la cible qui augmente la sensibilité de détection11,12. Ce qui distingue une de l’autre est la longueur de la séquence cible, qui est aussi courte que 50 nucléotides pour BaseScope et 300 – 1 000 nucléotides pour RNAscope. Ainsi, il est possible aux sondes de conception qui ciblent les jonctions exon-exon pour détecter des isoformes de mRNA alternatives spécifiques. Dans cette étude, une procédure a été créée pour examiner comme modèles d’expression de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) exon 23 a, un autre exon largement étudié dans le même laboratoire13,14,15 , 16 , 17, dans les sections de cerveau de souris. Les résultats démontrent que le BaseScope est un système idéal pour étudier les profils d’expression de Nf1 exon 23 bis in situ. Comme ce système de dosage peut être adapté à analyser comme modèles d’expression de nombreuses alternatives exons, il représente un nouvel outil puissant dans les études d’As.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette communication rend l’utilisation de BaseScope ARN ISH pour examiner comme modèles d’expression dans les sections de cerveau de souris. Il est démontré que la jonction anti-sens exon-exon sondes plus courte que 50 nucléotides peuvent cibler inclusion exon et sauter les isoformes solidement et plus précisément. En outre, les signaux qui en résulte peuvent être utilisés pour calculer les PSI d’un exon alternatif.
Quelques variantes ont été testées dans la procédure. Par e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association [subvention 0365274B à H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 à Z.W.], National Institutes of Health [Bureau de recherche Infrastructure partagée Instrumentation Grant S10RR031845 à la microscopie photonique Imaging Facility à Case Western Reserve University] et China Scholarship Council [à X.G.].
Les auteurs remercient Richard Lee dans la lumière microscopie Imaging Core pour son aide avec la numérisation de diapositives.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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