代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析
Summary
その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して記述されています。
Abstract
代替選択的スプライシング (AS) は、ヒトの遺伝子の 90% 以上で発生します。オルタナティブスプ エクソンの表現パターンは多くの場合セル型固有の方法で調整されます。パターンは通常 RT-PCR および RNA シーケンスによって分析される表現としての RNA のサンプルを使用してセルの人口から分離されました。試験では、その場の特定の生物学的構造の表現のパターンとしては、RNAの in situハイブリダイゼーションによる (っぽい) エクソン特異的プローブを用いた実施できます。ただし、代替のエクソン、一般的にエクソン特異的プローブの設計には短すぎるので、ISH のこの特定の使用が制限されています。本報告では、BaseScope、RNA ISH で短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを用いる最近開発された技術の使用はマウスの脳のセクションで式パターンとして分析する説明。神経線維腫型 (Nf1) 1 のエクソン 23 a は、短いエクソン エキソン接合プローブがマウスの脳のセクションの RNA っぽい分析に高い特異性と堅牢な交配のシグナルを示すことを説明するために例として使用されます。もっと重要なは、エクソン包含とスキップ特定プローブで検出される信号は確実にNf1エクソン 23a 式マウス脳の別の解剖学的領域での値でスプライス % を計算する使用できます。実験プロトコル、分析としての計算方法が掲載されています。BaseScope 式パターンとしてその場で評価するために強力な新しいツールを提供することが示唆されました。
Introduction
代替選択的スプライシング (AS) は、mRNA の成熟過程で発生する一般的なプロセスです。このプロセスで、エクソンは成熟した mRNA の差動含めることできます。したがって、AS を介して 1 つの遺伝子コードを生成できる多く Mrna その異なるタンパク質製品。推定されているヒトの遺伝子の 92-94% が代替スプライシング1,2を受けること。パターンをスプライシング異常の代わりに起因する遺伝の突然変異は、多数の疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋強直性ジストロフィーがん3,4などにリンクされています。つまり、調査し、人間の病気の新しい治療法を見つけるための代替選択的スプライシング制御機構を理解することが重要。
多くの場合セル型固有の方法で調整されます。特定の生物学的システムでの特定の遺伝子として発現パターンを調べることが重要です。しかし、これは脳や心臓などの細胞の多くの異なる種類を含む複雑な器官を学んだとき複雑になります。この場合、アッセイ システムの理想的な選択肢は、RNAの in situハイブリダイゼーション (っぽい) ティッシュを使用してセクションの特定の遺伝子として発現パターンを多くの細胞のタイプで同時に検出できます。確かに、エクソン特異的プローブは、代替エクソン5,6、7の発現レベルを評価するために使用されています。ただし、この方法は次の理由ではパターン分析としての適していません。まず、従来の ISH 法は通常 300 以上のプローブを使って bp、脊椎動物の内部エクソン (ない最初または最後エクソン) の平均のサイズは 170 ヌクレオチド8,9。第二に、内部代替エキソンの選択的スプライシングのパターンを調べるエクソン特異的プローブを使用すると、プローブによって検出のみの mRNA アイソ フォームは、エクソンは検出できませんなし mRNA アイソ フォームながら、エクソンが含まれている 1 つであります。したがって、代替のエクソンの値を (PSI) 融着接続割合の計算は複雑です。さらに、従来の蛍光っぽいはしばしば免疫染色は、検出効率と堅牢性を軽減っぽいを兼ね備えています。たとえば、ストレス誘発性を検討した研究ではスプライシング アイソ フォーム切り替えアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の mRNA、ジゴキシゲニンっぽいプローブに編入され、アンチ ジゴキシゲニン抗体を使用して検出されました。また、ビオチン標識プローブは、アルカリ性ホスファターゼ/ストレプトアビジン共役およびアルカリホスファターゼの10のための基板によって検出されました。どちらのメソッドでは、任意の拡大戦略を使用して、検出の感度を上げます。その結果、それは低レベルで発現する mrna の検出に挑戦します。したがって、表現のパターンとしてその場で分析する単純で丈夫っぽいアッセイ システムが必要です。
BaseScope は最近 RNAscope、老舗のプラットフォームをベースに開発され、広くっぽいアッセイ システムを使用します。両方のアッセイ系では、検出11,12の感度を高めるターゲット固有の増幅技術を採用しています。その他から 1 つを区別するものは BaseScope、50 のヌクレオチドと RNAscope の 300-1,000 ヌクレオチドとして短いターゲット シーケンスの長さです。したがって、ターゲット特定の代替の mRNA のアイソ フォームの検出するエクソン エキソン接合設計プローブすることが可能です。現在の研究では、神経線維腫の発現パターン入力 1 (Nf1) エクソン 23 a、同じ研究室13,14,15で手広く研究代替エクソンを調べる手順を設立,16,17マウスの脳のセクションで。結果は、BaseScope がNf1エクソン 23 a原の発現パターンを研究する理想的なシステムであることを示します。このアッセイ システムは、多くの代替のエクソンの発現パターンとして分析に適応できますが、それは AS の研究の強力な新しいツールを表します
Protocol
Representative Results
Discussion
この通信は、マウスの脳のセクションでの発現パターンを検討する BaseScope RNA っぽいの使用を報告します。そのアンチセンス エクソン エキソン接合プローブ エクソン包含およびしっかりと具体的にアイソ フォームをスキップを標的に 50 のヌクレオチドより短いことを示しています。さらに、結果として得られる信号は代替エクソンの PSI を計算する使用できます。
い?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アメリカの心臓協会 [HL を費 0365274B] によって支えられた国立がん研究所 [Z.W. に GI 胞子 P50CA150964] 国立衛生研究 [オフィスの研究インフラ共有計装グラント S10RR031845 にケース ウエスタン リザーブ大学の施設をイメージング、光学顕微鏡 】、【 名大 】 を中国奨学金理事会。
著者は彼の助けの光顕微鏡イメージング コア スライドのスキャニングとリチャード ・ リーをありがとうございます。
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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