Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay
Summary
Описан в situ гибридизация (ISH) протокол, использующий короткий антисмысловых олигонуклеотидов для выявления альтернативных пре мРНК сплайсинга модели в разделах мозга мыши.
Abstract
Альтернативного сплайсинга (AS) происходит в более чем 90% генов человека. Выражения в качестве альтернативы сращивания экзона часто регулируется в моде определенного типа клеток. КАК выражение, что шаблоны обычно анализируются RT-PCR и РНК seq с использованием образцов РНК изолированы от популяция клеток. В situ экспертиза как выражение шаблоны для определенной биологической структуры может осуществляться путем РНК в situ гибридизация (ISH) с помощью конкретных Эксон зондов. Однако этого конкретного использования иш был ограниченным, поскольку альтернативные экзонов, как правило, слишком короткий для разработки конкретных Эксон зонды. В настоящем докладе использование BaseScope, недавно разработанная технология, которая использует короткие антисмысловых олигонуклеотидов в РНК-иш, описанных для анализа как выражение шаблоны в разделах мозга мыши. Экзона 23a нейрофиброматоз типа 1 (Nf1) используется в качестве примера для иллюстрации, что короткие Экзон экзона Джанкшен зонды exhibit надежные гибридизации сигналы с высокой точностью в РНК ISH анализа на участках мозга мыши. Что еще более важно сигналы обнаружены датчиками включения и пропуск конкретных Эксон может использоваться надежно рассчитать процент сращивания в значениях Nf1 экзона 23a выражения в различных анатомических областях мозга мыши. Экспериментальный протокол и метод расчета для анализа представлены. Результаты показывают, что BaseScope предоставляет новый мощный инструмент для оценки в качестве выражений шаблонов в situ.
Introduction
Альтернативного сплайсинга (AS)-это общий процесс, который происходит во время созревания пре мРНК. В этом процессе экзона дифференциально могут быть включены в зрелой мРНК. Таким образом через AS, один ген может генерировать много мРНК код для различных белковых продуктов. Предполагается, что 92 – 94% генов человека проходят альтернативного сплайсинга1,2. Аномальные альтернативного сплайсинга шаблоны в результате генетических мутаций были связаны с большое количество заболеваний, в том числе боковой амиотрофический склероз, Миотоническая Дистрофия и рак3,4. Таким образом, важно изучить и лучше понять альтернативного сплайсинга механизмов регулирования в попытке найти новые методы лечения заболеваний человека.
КАК часто регулируются на основе конкретного типа ячейки. Важно определить шаблон AS выражения определенного гена в данной биологической системе. Однако это становится сложным, когда сложный орган, который содержит много различных типов клеток, таких как мозг или сердце, изучается. В этом случае идеальный выбор системы анализа является РНК в situ гибридизация (ISH) с использованием ткани разделы, так как выражения определенного гена могут быть обнаружены во многих типах клеток одновременно. Действительно конкретных Эксон зонды были использованы для оценки уровня выражения альтернативных экзона5,6,7. Однако этот подход не является хорошо подходит для, как анализ по следующим причинам. Во-первых, обычные методы иш обычно используют датчики, больше чем 300 bp, в то время как средний размер позвоночных внутреннего экзонов (не первый или последний экзона) составляет 170 нуклеотидов8,9. Во-вторых когда конкретных Эксон зонда используется для изучения сплайсинга шаблон внутренней альтернативных экзона, только изоформы мРНК, обнаруженных зонд является тот, который содержит экзона, в то время как мРНК изоформы без экзона не могут быть обнаружены. Таким образом расчет процентов, сращивания (PSI) значение для альтернативных экзона является сложным. Кроме того обычные флуоресцентные иш часто сочетаются иш иммуноокрашивания, что снижает эффективность обнаружения и надежность. Например, в исследовании, которая расследовала стресс индуцированного сплайсинга изоформы переключение ацетилхолинэстеразы (АВО) мРНК, digoxigenin была включена в ISH зонд и обнаружить с помощью антител анти digoxigenin. Кроме того биотин меченых зонд был обнаружен конъюгата щелочной фосфатазы/стрептавидина и субстрата для10щелочной фосфатазы. Чтобы увеличить чувствительность обнаружения ни метод использует любой стратегии усиления. В результате это сложно обнаружить стенограммы мРНК, которые выражаются на низком уровне. Таким образом проще и более надежна иш пробирного система необходима для анализа как выражение шаблонов в situ.
BaseScope недавно была разработана на основе платформы RNAscope, устоявшихся и широко используется иш пробирного системы. Обе системы анализа используют амплификации целевые технологии, которая увеличивает чувствительность обнаружения11,12. Что отличает друг от друга — Длина последовательности целевых объектов, которая как 50 нуклеотиды для BaseScope и 300 – 1000 нуклеотидов для RNAscope коротким. Таким образом это возможно для дизайн зонды, выполняемых Экзон экзона развязок для выявления конкретных альтернативных мРНК изоформ. В текущем исследовании процедура была создана для изучения как выражение модели нейрофиброматоз типа 1 (Nf1) экзона 23a, альтернативных экзона, широко учился в13,же лаборатории,14,,15 , 16 , 17, в разделах мозга мыши. Результаты показывают, что BaseScope является идеальной системой для изучения моделей выражение Nf1 экзона 23a в situ. Как эта система анализа может быть адаптирована для анализа как выражение модели многих альтернативных экзонов, он представляет новый мощный инструмент в исследованиях AS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это сообщение сообщает использование BaseScope РНК ISH для изучения как выражение шаблоны в разделах мозга мыши. Доказано, что что анти чувство Экзон экзона Джанкшен зонды короче, чем 50 нуклеотидов можно ориентировать экзона включение и пропуск изоформ решительно и конкретно. Кроме того рез?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана американская ассоциация сердца [субсидий 0365274B к H.L.], Национальный институт рака [GI SPORE P50CA150964 к Z.W.], национальные институты здравоохранения [Управление из исследовательской инфраструктуры совместно инструментария Грант S10RR031845 для Световой микроскопии изображений объекта на Западный резервный университет Кейза] и Китай стипендию Совета [X.G.].
Авторы благодарят Ричард ли в свет микроскопии изображений ядре за его помощь с сканирование слайдов.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
