Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay
Summary
Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.
Abstract
Alternatieve splicing (AS) treedt op in meer dan 90% van menselijke genen. Het expressiepatroon van een alternatief afgesplitste exon wordt vaak geregeld in een cel type-specifieke mode. Als expressie patronen zijn doorgaans geanalyseerd door RT-PCR en RNA-seq geïsoleerd met behulp van RNA monsters van een bevolking van cellen. In situ als voor een bepaalde biologische structuur-expressiepatronen kunnen worden onderzocht door RNA in situ hybridisatie (ISH) met behulp van de exon-specifieke sondes. Echter, dit bepaald gebruik van ISH beperkt gebleven omdat alternatieve exons zijn over het algemeen te kort om te ontwerpen exon-specifieke sondes. In dit verslag is het gebruik van BaseScope, een onlangs ontwikkelde technologie die gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides in RNA ISH, om te analyseren als expressiepatronen in muis hersenen secties beschreven. Exon 23a van Neurofibromatose type 1 (Nf1) wordt gebruikt als een voorbeeld om te illustreren dat korte exon-exon junction sondes robuuste hybridisatie signalen met hoge specificiteit in RNA ISH analyse op muis hersenen secties exposeren. Nog belangrijker, kunnen signalen gedetecteerd met exon integratie – en overslaan-specifieke sondes worden gebruikt voor het op betrouwbare wijze berekenen van het percentage verbinding aan de randen in waarden van Nf1 exon 23a expressie in verschillende anatomische gebieden van de hersenen van een muis. De experimentele protocol en de methode voor de berekening als analyse worden gepresenteerd. De resultaten wijzen erop dat BaseScope biedt een krachtige nieuwe tool om te beoordelen als expressie patronen in situ.
Introduction
Alternatieve splicing (AS) is een algemeen voorkomend proces dat zich tijdens de rijping van de pre-mRNA voordoet. In dit proces kan een exon differentieel worden opgenomen in volwassen mRNA. Dus, door middel van AS, één gen kunt vele mRNAs die code genereren voor verschillende eiwitproducten. Geschat wordt dat 92 – 94% van menselijke genen ondergaan alternatieve splicing1,2. Het gevolg van abnormale alternatieve splicing patronen van genetische mutaties zijn gekoppeld aan een groot aantal ziekten, waaronder kanker3,4, Amyotrofische laterale sclerose en myotone dystrofie. Het is dus van cruciaal belang om te onderzoeken en alternatieve splicing regulerende mechanismen in een poging om te vinden van nieuwe behandelingen van ziekten bij de mens beter te begrijpen.
ZOALS vaak in een cel type-specifieke manier wordt geregeld. Het is belangrijk om te bepalen van het AS-expressiepatroon van een specifiek gen in een bepaald biologisch systeem. Dit wordt echter ingewikkeld wanneer een complex orgaan dat veel verschillende soorten cellen, zoals de hersenen of het hart bevat, wordt bestudeerd. In dit geval is een ideale keuze van assay systeem RNA in situ hybridisatie (ISH) met behulp van weefsel secties zodat het AS-expressiepatroon van een specifiek gen kan worden opgespoord in veel celtypen tegelijk. Inderdaad, exon-specifieke sondes zijn gebruikt voor de beoordeling van de niveaus van de expressie van een alternatieve exon5,6,7. Deze aanpak is echter niet geschikt voor als patroon analyse om de volgende redenen. Eerste, conventionele ISH methoden gebruiken meestal langer dan 300 sondes bp, terwijl de gemiddelde grootte van gewervelde interne exons (niet eerste of laatste exon) 170 nucleotiden8,9 is. Ten tweede, wanneer een exon-specifieke sonde wordt gebruikt voor het onderzoeken van de splicing patroon van een interne alternatieve exon, de enige mRNA isovorm gedetecteerd door de sonde is degene die de exon, terwijl de isovorm van het mRNA bevat zonder de exon kan niet worden gedetecteerd. Berekening van het percentage verbinding aan de randen (PSI) waarde voor de alternatieve exon is zo ingewikkeld. Bovendien combineert conventionele TL ISH vaak ISH met immunokleuring, waardoor de detectie efficiëntie en robuustheid. Bijvoorbeeld, in een studie die de stress-geïnduceerde onderzocht splicing isovorm over te schakelen van de acetylcholinesterase (AChE) mRNA, heksenkruid werd opgenomen in de sonde ISH en gedetecteerd met behulp van anti-heksenkruid antilichaam. Als alternatief, Biotine-geëtiketteerden sonde werd ontdekt door een conjugaat alkalische fosfatase/daar en een substraat voor alkalische fosfatase10. Noch methode maakt gebruik van elke strategie versterking te verhogen van de gevoeligheid van detectie. Dientengevolge, is het uitdagend om te detecteren van mRNA afschriften die op een laag niveau worden uitgedrukt. Dus is een eenvoudiger en robuuster ISH assay systeem nodig om te analyseren als expressie patronen in situ.
BaseScope onlangs werd ontwikkeld op basis van het platform van RNAscope, een gevestigde en ISH assay systeem op grote schaal gebruikt. Beide assay-systemen gebruiken een doelgroepen gerichte versterking-technologie die een toename van de gevoeligheid van detectie11,12. Wat onderscheidt van elkaar, is de lengte van de reeks van de doelgroep, die zo 50 nucleotiden voor BaseScope en 300-1000 nucleotiden voor RNAscope kort. Het is dus mogelijk om ontwerp-sondes die gericht zijn op exon-exon kruispunten te sporen specifieke alternatieve mRNA isoforms. In de huidige studie, werd een procedure opgericht te onderzoeken zoals expressiepatronen van Neurofibromatose type 1 (Nf1) exon 23a, een alternatieve exon uitgebreid bestudeerd in de dezelfde laboratorium13,14,15 , 16 , 17, in muis hersenen secties. De resultaten tonen aan dat BaseScope is een ideaal systeem om te studeren-expressiepatronen van Nf1 exon 23a in situ. Zoals dit assay-systeem aangepast om te analyseren als expressiepatronen van vele alternatieve exons worden kan, vormt het een krachtige nieuwe tool in de studies van AS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze mededeling wordt verslag uitgebracht het gebruik van BaseScope RNA ISH te onderzoeken als uitdrukking patronen in muis hersenen secties. Het is aangetoond dat anti-zin exon-exon junction sondes korter dan 50 nucleotiden richten kunnen exon integratie en isoforms krachtig en specifiek overslaan. Bovendien kunnen de resulterende signalen worden gebruikt voor het berekenen van de PSI van een alternatieve exon.
Een paar variaties werden getest in de procedure. Bijvoorbeeld, werden bevroren we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de American Heart Association [Grant-in-Aid 0365274B naar H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 aan Z.W.], National Institutes of Health [Office van onderzoek infrastructuur gedeeld Instrumentation Grant S10RR031845 aan de lichte microscopie Imaging faciliteit aan de Case Western Reserve University], en China Scholarship Raad [X.G.].
De auteurs danken Richard Lee in de lichte microscopie Imaging Core voor zijn hulp met dia scannen.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
