التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة
Summary
ويرد وصف بروتوكولا تهجين (ايش) في الموقع الذي يستخدمه النوكليوتيد العقاقير قصيرة للكشف عن أنماط الربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس.
Abstract
يحدث الربط بديلة (AS) في أكثر من 90% جينات البشرية. نمط التعبير إكسون المقسمة بدلاً من ذلك غالباً ما تنظم بطريقة خاصة بنوع خلية. كالتعبير عادة يتم تحليل أنماط RT-PCR وتسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام عينات الحمض النووي الريبي معزولة عن أن خلايا. يمكن الاضطلاع في الموقع دراسة أنماط التعبير عن بنية بيولوجية خاصة بالجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين (العش) استخدام المسابير إكسون-محددة. بيد هذا الاستخدام بالتحديد من العش كان محدودا نظراً لأن exons بديلة تكون عادة قصيرة جداً لتصميم إكسون-خاصة بالمجسات. في هذا التقرير، يرد استخدام باسيسكوبي، تكنولوجيا المتقدمة مؤخرا التي توظف النوكليوتيد العقاقير قصيرة في الجيش الملكي النيبالي العش، لتحليل أنماط التعبير في أقسام الدماغ الماوس. إكسون 23 ألف من الورم العصبي الليفي النمط 1 (Nf1) كمثال لتوضيح أن المسابير مفرق القصير إكسون-إكسون يحمل إشارات قوية التهجين مع خصوصية عالية في تحليل الحمض النووي الريبي العش في أقسام الدماغ الماوس. الأهم من ذلك، يمكن استخدام إشارات الكشف مع إكسون إدراج تخطي محددة وتحقيقات لحساب موثوق % تقسم في قيم Nf1 إكسون 23a التعبير في مختلف المجالات التشريحية للدماغ الماوس. ويعرض البروتوكول التجريبي وطريقة الحساب كالتحليل. وتبين النتائج أن باسيسكوبي يوفر أداة قوية جديدة لتقييم كتعبير الأنماط في الموقع.
Introduction
الربط بديلة (AS) هو عملية شائعة التي تحدث أثناء النضج قبل مرناً. في هذه العملية، يمكن تضمين إكسون متفاوتاً في مرناً ناضجة. وهكذا، من خلال، أحد الجينات يمكن توليد مرناس العديد من التعليمات البرمجية لمنتجات مختلفة من البروتين. ومن المقدر أن 92 – 94% جينات البشرية الخضوع للربط البديل1،2. نتجت عن بديل طبيعي الربط أنماط الطفرات الوراثية قد ربطت بعدد كبير من الأمراض، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي وضمور ميوتونيك والسرطان3،4. وبالتالي من الأهمية بمكان التحقيق، وفهم أفضل لآليات تنظيمية الربط بديلة في محاولة لإيجاد علاجات جديدة للأمراض التي تصيب الإنسان.
كما غالباً ما تنظم بطريقة خاصة بنوع خلية. من المهم تحديد نمط التعبير كجين معين في نظام بيولوجي معين. ومع ذلك، هذا يصبح معقداً عند جهاز معقد يحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الدماغ أو القلب، وهو درس. وفي هذه الحالة، هو خياراً مثاليا لنظام تحليل الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين (العش) استخدام أنسجة الفروع حيث يمكن اكتشاف نمط التعبير كجين معين في العديد من أنواع الخلايا في وقت واحد. وفي الواقع، استخدمت تحقيقات خاصة إكسون لتقييم مستويات التعبير إكسون البديلة5،،من67. غير أن هذا النهج ليس مناسبة لتحليل نمط للأسباب التالية. أولاً، التقليدية وأساليب العش عادة استخدام المسابير أطول من 300 شركة بريتيش بتروليوم، بينما متوسط حجم exons الداخلية الفقاريات (إكسون ليس الأول أو الأخير) هو 170 النيوكليوتيدات8،9. ثانيا، عندما يتم استخدام مجس إكسون على حدة دراسة نمط إكسون بديلة داخلية الربط، isoform مرناً فقط الكشف عنها بواسطة المسبار هو واحد يحتوي على إكسون، بينما isoform مرناً دون إكسون لا يمكن الكشف عنها. وهكذا، معقد لحساب نسبة تقسم في قيمة إكسون البديلة (PSI). وعلاوة على ذلك، يجمع العش الفلورسنت التقليدية غالباً ما العش مع إيمونوستينينج، مما يقلل من كفاءة الكشف ومتانة. على سبيل المثال، في دراسة أن التحقيق الإجهاد الناجم عن الربط isoform التبديل من أستيلكولينستراز (وجع) مرناً، أدمجت في التحقيق العش ديجوكسيجينين والكشف عن استخدام الأجسام المضادة ديجوكسيجينين. وبدلاً من ذلك، تم الكشف عن مسبار المسمى البيوتين المتقارن الفوسفاتيز قلوية/ستريبتافيدين وركيزة الفوسفاتيز القلوية10. يستخدم الأسلوب لا أي استراتيجية التضخيم لزيادة حساسية الكشف. نتيجة لذلك فإنه يمثل تحديا للكشف عن النصوص مرناً التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة. وهكذا، يلزم وجود نظام مقايسة ايش أبسط وأكثر قوة لتحليل كتعبير الأنماط في الموقع.
باسيسكوبي مؤخرا قد وضعت استناداً إلى منصة رناسكوبي، راسخة، وتستخدم على نطاق واسع نظام مقايسة العش. كلا النظامين المقايسة تستخدم تقنية تضخيم محددة الهدف الذي يزيد من حساسية الكشف عن11،12. وما يميز أحدهما من الآخر هو طول التسلسل المستهدفة، وقصيرة بقدر النيوكليوتيدات 50 باسيسكوبي، والنيوكليوتيدات 300 – 1,000 رناسكوبي. وهكذا، من الممكن تصميم المجسات التي تستهدف تقاطعات إكسون-إكسون للكشف عن isoforms مرناً بديلة محددة. في الدراسة الحالية، وتم وضع إجراء لدراسة أنماط التعبير [نيوروفيبرومتوسس] الكتابة 1 (Nf1) إكسون 23 ألف، إكسون بديلة درس على نطاق واسع في نفس المختبر13،،من1415 , 16 , 17، في أقسام الدماغ الماوس. النتائج تثبت أن باسيسكوبي نظام مثالي لدراسة أنماط التعبير من Nf1 إكسون 23 ألف في الموقع. كما يمكن أن يكون هذا النظام مقايسة تكييفها لتحليل أنماط التعبير من exons بديلة كثيرة، أنه يمثل أداة جديدة قوية في دراسات as.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا الاتصال تقارير استخدام “العش باسيسكوبي الجيش الملكي النيبالي” القيام بدراسة أنماط التعبير في أقسام الدماغ الماوس. ثبت تقاطع الشعور المضادة إكسون-إكسون أن يسبر أقصر مما يمكن استهداف النيوكليوتيدات 50 إدراج إكسون وتخطي isoforms قويا، وعلى وجه التحديد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الإشارات ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “جمعية القلب الأمريكية” [معونات 0365274B إلى H.L.]، المعهد الوطني للسرطان [بوغ غي P50CA150964 إلى Z.W.]، “المعاهد الوطنية للصحة” [مكتب للبحوث البنية التحتية المشتركة الأجهزة منحة S10RR031845 إلى مجهرية الخفيفة التصوير مرفق في جامعة الاحتياطي الغربية حالة]، ومجلس المنح الدراسية الصيني [على X.G.].
يشكر المؤلفون ريتشارد لي في “صميم التصوير الضوء الفحص المجهري” لمساعدته مع الشريحة المسح الضوئي.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
