वैकल्पिक पूर्व का मात्रात्मक विश्लेषण माउस मस्तिष्क वर्गों में mRNA ब्याह सीटू संकरण परख में आरएनए का उपयोग
Summary
माउस मस्तिष्क वर्गों में वैकल्पिक पूर्व mRNA ब्याह पैटर्न का पता लगाने के लिए लघु antisense oligonucleotides का उपयोग करता है कि सीटू संकरण (ISH) प्रोटोकॉल में एक वर्णित है ।
Abstract
वैकल्पिक ब्याह (के रूप में) मानव जीन के ९०% से अधिक में होता है । एक वैकल्पिक ब्याह एक्सॉन की अभिव्यक्ति पैटर्न अक्सर एक सेल प्रकार विशेष फैशन में विनियमित है । के रूप में अभिव्यक्ति पैटर्न आमतौर पर आरटी-पीसीआर और आरएनए-seq आरएनए कोशिकाओं की आबादी से अलग नमूनों का उपयोग करके विश्लेषण कर रहे हैं । एक विशेष रूप से जैविक संरचना के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में सीटू की परीक्षा में एक्सॉन-विशिष्ट जांच का उपयोग कर सीटू संकरण (ISH) में आरएनए द्वारा किया जा सकता है । हालांकि, ISH के इस विशेष उपयोग सीमित किया गया है क्योंकि वैकल्पिक exons आम तौर पर भी एक्सॉन विशिष्ट जांच डिजाइन करने के लिए कम कर रहे हैं । इस रिपोर्ट में, BaseScope का उपयोग, एक हाल ही में विकसित तकनीक है कि आरएनए ISH में लघु antisense oligonucleotides रोजगार, माउस मस्तिष्क वर्गों में अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण करने के लिए वर्णन किया गया है । एक्सॉन 23 क of neurofibromatosis type 1 (Nf1) एक उदाहरण के रूप में वर्णन करने के लिए कि लघु एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन जांच में उच्च विशिष्टता के साथ मजबूत संकरण संकेतों को दर्शाने के लिए प्रयोग किया जाता है आरएनए पर माउस मस्तिष्क वर्गों ISH विश्लेषण । इससे भी महत्वपूर्ण बात, संकेतों एक्सॉन शामिल किए जाने के साथ पता लगाया-और लंघन-विशिष्ट जांच मज़बूती से एक माउस मस्तिष्क के विभिंन संरचनात्मक क्षेत्रों में Nf1 एक्सॉन 23 क अभिव्यक्ति के मूल्यों में ब्याह प्रतिशत की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और गणना पद्धति प्रस्तुत कर रहे हैं । परिणाम संकेत मिलता है कि BaseScope एक शक्तिशाली नए उपकरण के रूप में सीटू मेंअभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में मूल्यांकन प्रदान करता है ।
Introduction
वैकल्पिक ब्याह (के रूप में) एक आम प्रक्रिया है कि पूर्व mRNA परिपक्वता के दौरान होता है । इस प्रक्रिया में, एक एक्सॉन अंतर परिपक्व mRNA में शामिल किया जा सकता है । इस प्रकार, के माध्यम से के रूप में, एक जीन कई mRNAs उत्पंन कर सकते है कि विभिंन प्रोटीन उत्पादों के लिए कोड । यह अनुमान है कि 92-मानव जीन के 94% वैकल्पिक ब्याह1,2से गुजरना है । असामान्य वैकल्पिक ब्याह पैटर्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों से परिणामस्वरूप पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, myotonic dystrophy, और3कैंसर,4सहित रोगों की एक बड़ी संख्या से जोड़ा गया है । यह इस प्रकार की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और बेहतर मानव रोगों के नए उपचार खोजने के प्रयास में वैकल्पिक ब्याह विनियामक तंत्र को समझते हैं ।
के रूप में अक्सर एक सेल प्रकार विशेष फैशन में विनियमित है । यह एक विशिष्ट जीन के रूप में एक दिया जैविक प्रणाली में अभिव्यक्ति पैटर्न का निर्धारण महत्वपूर्ण है । हालांकि, यह जटिल हो जाता है जब एक जटिल अंग है कि कई विभिंन प्रकार की कोशिकाओं में शामिल है, जैसे मस्तिष्क या दिल, अध्ययन किया है । इस मामले में, परख प्रणाली का एक आदर्श विकल्प एक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में एक साथ कई कोशिका प्रकार में पता लगाया जा सकता है तो ऊतक वर्गों का उपयोग कर सीटू संकरण (ISH) में आरएनए है । दरअसल, एक्सॉन-विशिष्ट जांच एक वैकल्पिक एक्सॉन5,6,7की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए निंनलिखित कारणों के लिए पैटर्न विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है । सबसे पहले, पारंपरिक ISH तरीकों आमतौर पर जांच का उपयोग ३०० बीपी से अधिक है, जबकि हड्डीवाला आंतरिक exons के औसत आकार (नहीं पहले या अंतिम एक्सॉन) १७० न्यूक्लियोटाइड8,9है । दूसरा, जब एक एक्सॉन-विशिष्ट जांच एक आंतरिक वैकल्पिक एक्सॉन के ब्याह पैटर्न की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है, केवल mRNA isoform जांच से पता चला है एक है कि एक्सॉन शामिल है, जबकि mRNA isoform बिना पता नहीं किया जा सकता है । इस प्रकार, वैकल्पिक एक्सॉन के लिए (साई) मूल्य में ब्याह प्रतिशत की गणना जटिल है । इसके अलावा, पारंपरिक फ्लोरोसेंट ish अक्सर immunostaining के साथ ish को जोड़ती है, जो पता लगाने दक्षता और मजबूती कम कर देता है । उदाहरण के लिए, एक अध्ययन है कि तनाव से प्रेरित ब्याह एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ के isoform स्विचन (दर्द) mRNA की जांच में, digoxigenin ISH जांच में शामिल किया गया था और विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया । वैकल्पिक रूप से, बायोटिन-लेबल जांच एक alkaline फॉस्फेट/streptavidin संयुग्मी और क्षारीय फॉस्फेट10के लिए एक सब्सट्रेट द्वारा पता लगाया गया था । न तो विधि का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए किसी भी प्रवर्धन रणनीति का उपयोग करता है । नतीजतन, यह mRNA टेप है कि निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे है का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, एक सरल और अधिक मजबूत ISH परख प्रणाली को सीटू मेंअभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण की जरूरत है ।
BaseScope हाल ही में RNAscope, एक अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया ISH परख प्रणाली के मंच के आधार पर विकसित किया गया था । दोनों परख प्रणालियों एक लक्ष्य विशेष प्रवर्धन प्रौद्योगिकी है कि पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती रोजगार11,12। क्या दूसरे से अलग एक लक्ष्य अनुक्रम की लंबाई है, जो BaseScope के लिए ५० न्यूक्लियोटाइड के रूप में के रूप में कम है, और 300-RNAscope के लिए 1000 न्यूक्लियोटाइड । इस प्रकार, यह डिजाइन जांच करने के लिए संभव है कि लक्ष्य एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों विशिष्ट वैकल्पिक mRNA isoforms का पता लगाने के लिए । वर्तमान अध्ययन में, एक प्रक्रिया neurofibromatosis प्रकार की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में जांच करने के लिए स्थापित किया गया था 1 (Nf1) एक्सॉन 23 क, एक वैकल्पिक एक्सॉन बड़े पैमाने पर एक ही प्रयोगशाला में अध्ययन13,14,15 , 16 , 17, माउस मस्तिष्क वर्गों में । परिणाम प्रदर्शित करता है कि BaseScope एक आदर्श प्रणाली को सीटू में Nf1 एक्सॉन 23 क के अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन है । के रूप में इस परख प्रणाली के लिए कई वैकल्पिक exons की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है, यह के रूप में अध्ययन में एक शक्तिशाली नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस संचार BaseScope आरएनए ISH के उपयोग के लिए माउस मस्तिष्क वर्गों में अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में जांच रिपोर्ट । यह प्रदर्शित किया जाता है कि विरोधी भावना एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन जांच से कम ५० न्यूक्लियोटाइड एक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था [अनुदान-इन-एड 0365274B to H.L.], राष्ट्रीय कैंसर संस्थान [सैनिक बीजाणु P50CA150964 to Z.W.], राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [कार्यालय ऑफ रिसर्च इन्फ्रास्ट्रक्चर साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट S10RR031845 मामला पश्चिमी रिजर्व विश्वविद्यालय में प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा], और चीन छात्रवृत्ति परिषद [X.G. करने के लिए] ।
लेखकों ने स्लाइड स्कैनिंग के साथ अपनी मदद के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कोर में रिचर्ड ली का शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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