Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen
Summary
En i situ hybridisering (ISH) protokoll som bruker korte antisense oligonucleotides for å finne alternative pre-mRNA skjøting mønstre i musen hjernen delene er beskrevet.
Abstract
Alternativ skjøting (AS) oppstår i mer enn 90% av menneskets gener. Uttrykksmønster i en alternativt skjøtes ekson er ofte regulert i en celle type-spesifikk måte. SOM uttrykk mønstre er vanligvis analysert av RT PCR og RNA-seq RNA utvalg isolert fra en populasjon av celler. In situ undersøkelse av som uttrykk mønstre for en bestemt biologiske struktur kan utføres av RNA i situ hybridisering (ISH) bruker ekson-spesifikke sonder. Men er bruk ish begrenset fordi alternativ exons er generelt for kort til å utforme ekson-spesifikke sonder. I denne rapporten er bruk av BaseScope, en nylig utviklet teknologi som sysselsetter kort antisense oligonucleotides i RNA ISH, beskrevet å analysere som uttrykk mønstre i musen hjernen deler. Ekson 23a av Nevrofibromatose type 1 (Nf1) brukes som et eksempel for å illustrere at kort ekson-ekson krysset sonder ha robust hybridisering signaler med høy spesifisitet RNA ISH analyse på musen hjernen deler. Enda viktigere, kan signaler oppdaget med ekson inkludering og hoppe-spesifikke sonder brukes til å beregne pålitelig prosent skjøtes i Nf1 ekson 23a uttrykk i ulike anatomiske områder av musen hjerne-verdiene. Eksperimentell protokollen og beregningsmetoden for som analyse presenteres. Resultatene indikerer at BaseScope gir et kraftig nytt verktøy til som uttrykk mønstre i situ.
Introduction
Alternativ skjøting (AS) er en felles prosess som oppstår under pre-mRNA modning. I denne prosessen, kan en ekson være ulikt inkludert i eldre mRNA. Dermed gjennom AS, kan genet generere mange mRNAs koden for annet protein produkter. Det anslås at 92-94% av menneskets gener gjennomgå alternativ skjøting1,2. Unormal alternativ skjøting mønster skyldes genetiske mutasjoner er knyttet til en rekke sykdommer, inkludert amyotrofisk lateral sklerose, myotonic dystrophy og kreft3,4. Det er derfor avgjørende å undersøke og bedre forstå alternativ skjøting regulatoriske mekanismer i et forsøk på å finne nye behandlinger av menneskelige sykdommer.
SOM ofte er regulert i en celle type-spesifikk måte. Det er viktig å bestemme AS uttrykksmønster av et bestemt gen i et biologisk system. Men blir dette komplisert når en komplisert organ som inneholder mange forskjellige typer celler, for eksempel hjernen eller hjertet, er studert. I dette tilfellet er et ideelt valg av analysen RNA i situ hybridisering (ISH) ved hjelp av vev seksjoner slik AS uttrykk mønsteret med et bestemt kan påvises i mange celletyper samtidig. Ekson-spesifikke sonder har faktisk brukt til å vurdere uttrykk nivåer av en alternativ ekson5,6,7. Men er denne tilnærmingen ikke godt egnet for som mønster analyse av følgende årsaker. Første, konvensjonelle ISH metoder bruker vanligvis sonder lengre enn 300 bp, mens den gjennomsnittlige størrelsen på virveldyrenes interne exons (ikke første eller siste ekson) er 170 nukleotider8,9. Andre når en ekson-spesifikke sonde undersøke skjøting mønster av en intern alternativ ekson, er den eneste mRNA isoformen oppdaget av sonden som inneholder ekson, mens mRNA isoformen uten ekson ikke kan oppdages. Dermed er beregning av prosent skjøtes i (PSI) verdi for den alternative ekson komplisert. Videre kombinerer konvensjonelle fluorescerende ISH ofte ISH med immunostaining, som reduserer effektiviteten deteksjon og robusthet. For eksempel i en studie som undersøkte stress-indusert skjøting isoformen bytte av acetylcholinesterase (verke) mRNA, digoxigenin ble innlemmet i ISH sonden og oppdaget bruker anti-digoxigenin antistoff. Alternativt ble biotin-merket sonde oppdaget av en alkalisk fosfatase/streptavidin konjugert og et substrat for alkalisk fosfatase10. Verken metoden bruker en forsterkning strategi for å øke sensitiviteten av gjenkjenning. Som et resultat, er det utfordrende for å oppdage mRNA utskrifter som er uttrykt ved lave nivåer. Dermed er en enklere og mer robust ISH analysen system nødvendig for å analysere som uttrykk mønstre i situ.
BaseScope ble nylig utviklet basert på plattformen for RNAscope, godt etablert og brukte ISH analysen systemet. Begge analysen systemer benytter en mål-spesifikke forsterkning teknologi som øker følsomheten til gjenkjenning11,12. Hva skiller fra hverandre er målet sekvensen, som er så kort som 50 nukleotider for BaseScope og 300-1000 nukleotider for RNAscope. Dermed er det mulig å design sonder som mål ekson-ekson Forbindelsesstykke å oppdage bestemte alternativ mRNA isoformene. I denne studien, ble en prosedyre etablert for å undersøke som uttrykk mønstre av Nevrofibromatose type 1 (Nf1) ekson 23a, en alternativ ekson grundig studert i samme laboratorium13,14,15 , 16 , 17i musen hjernen deler. Resultatene viser at BaseScope er et ideelt system å studere uttrykk bruksmønstre Nf1 ekson 23a i situ. Som denne analysen systemet kan tilpasses analyserer uttrykk mønstre av mange alternative exons, representerer den et kraftig nytt verktøy i studier av AS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne kommunikasjonen rapporterer bruk av BaseScope RNA ISH undersøke som uttrykk mønstre i musen hjernen deler. Det er vist at anti-følelse ekson-ekson krysset sonder kortere enn 50 nukleotider kan målrette ekson inkludering og overshopping isoformene robustly og spesielt. Videre kan det resulterende signaler brukes til å beregne PSI i en alternativ ekson.
Noen varianter ble testet i prosedyren. For eksempel ble frossent deler generert av kryostaten snitting testet og vist seg å være v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association [Grant-in-Aid 0365274B å H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 å Z.W.], National Institutes of Health [Office for forskning infrastruktur delt instrumentering Grant S10RR031845 til den * lys Imaging anlegg ved Case Western Reserve University], og Kina stipend råd [X.G.].
Forfatterne takker Richard Lee i lys mikroskopi Imaging kjernen for hans hjelp med slide skanning.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
