Isolering af atrieflimren Cardiomyocytes fra en rotte Model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion
Summary
Her, beskriver vi en optimeret, Langendorff-baseret procedure til isolering af enkelt celle atrieflimren cardiomyocytes fra en rotte model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion. En manuel regulering af intraluminal pres af hjertets hulrum er gennemført for at give funktionelt intakt myocytes egnet til magnetisering sammentrækning kobling undersøgelser.
Abstract
I denne artikel vil vi beskrive en optimeret, Langendorff-baseret procedure til isolering af enkelt celle atrieflimren cardiomyocytes (ACMs) fra en rotte model af metabolisk syndrom (MetS)-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion (HFpEF). Forekomsten af MetS-relaterede HFpEF er stigende, og atrieflimren cardiomyopatier forbundet med atrieflimren remodellering og atrieflimren er klinisk meget relevante som atrial remodellering er en uafhængig prædiktor for dødelighed. Undersøgelser med isolerede encellede cardiomyocytes bruges ofte til at bekræfte og supplere i vivo resultater. Kredsløbssygdomme fartøj rarefication og interstitielle væv fibrose udgør et potentielt begrænsende faktor for succesfuld encellede isolation ACMs fra dyremodeller for denne sygdom.
Vi har behandlet dette spørgsmål ved at ansætte en enhed i stand til manuelt regulering intraluminal presset af hjertets hulrum under proceduren isolation væsentligt øge udbyttet af morfologisk og funktionelt intakt ACMs. De erhvervede celler kan bruges i en række forskellige eksperimenter, som cellekultur og funktionelle Calcium imaging (dvs., excitation sammentrækning kobling).
Vi give forskeren en trinvis protokol, en liste over optimerede løsninger, grundig vejledning til at forberede det nødvendige udstyr, og en omfattende fejlfindingsvejledning. Mens den indledende implementering af proceduren kan være temmelig vanskeligt, vil en vellykket tilpasning tillader læseren at udføre state-of-the-art ACM isolering i en rotte model af MetS-relaterede HFpEF for et bredt spektrum af eksperimenter.
Introduction
MetS beskriver en klynge af risikofaktorer for diabetes mellitus type-2 og hjerte-kar-sygdom og omfatter et øget arterielt blodtryk, dyslipidæmi (rejst triglycerider og sænket high-density lipoprotein kolesterol), øget fastende glukose, og centrale fedme1. Den verdensomspændende forekomsten af MetS skønnes for at være 25-30% og konstant stigende2. HFpEF er en heterogene klinisk syndrom ofte forbundet med MetS. Den kardiale remodeling under HFpEF og dens foregående faser (dvs., hypertensive hjertesygdomme) er også ledsaget af en ombygning af atria3. Reduceret kontraktile funktion og strukturelle ændringer af venstre atrium har været forbundet med øget dødelighed, atrieflimren og ny-debut hjertesvigt4. Atrieflimren remodellering er karakteriseret ved ændringer i ion-kanal funktion, Ca2 + homøostase, atrieflimren struktur, fibroblast aktivering og væv fibrose5. Venstre atriale remodeling i MetS-relaterede HFpEF og dens underliggende patologiske mekanismer er stadig dårligt forstået og kræver en yderligere grundig undersøgelse. Dyremodeller har vist sig at være et værdifuldt værktøj og føre til mange fremskridt inden for atrieflimren cardiomyopatier6,7,8,9.
Undersøgelser med isolerede encellede cardiomyocytes bruges ofte til at bekræfte og supplere i vivo resultater. En isolation, og den potentielle efterfølgende cellekultur, mulighed for undersøgelse af signalering veje, ionisk kanal strømninger og excitation sammentrækning kobling. Fysiologisk betingelser, cardiomyocytes ikke formere. Fusion mellem transkriptionel regulering sekvenser af en atrial natriuretic faktor og en simian 40 store T virusantigen i Transgene mus førte til oprettelsen af de første udødeliggjort ACMs, navnet på-110. Videreudvikling af i-1 celler gav anledning til HL-1 celler, der ikke kun være seriefremstillede passaged men også kontrakt spontant11. De viser imidlertid strukturelle og funktionelle forskelle i forhold til frisk isolerede celler, såsom en mindre organiseret ultrastruktur, en høj forekomst af udvikling af myofibrils11og en hyperpolarisering-aktiveret indad nuværende12. Isolering af ventrikulær cardiomyocytes (VCM) i rotter og mus fra en række forskellige modeller er veletableret13,14,15,16,17,18 , 19. generelt, skåret hjertet er monteret på en Langendorff apparatur og retrogradely perfunderet med en Ca2 +-gratis buffer indeholdende fordøjelsesenzymer, såsom collagenases og proteaser. Calcium er derefter genindført i en trinvis måde de fysiologiske forhold. Men selv om protokollerne dedikeret til isolering af ACMs er tilgængelige20,21, på grund af øget fibrose og pres-relaterede forskelle, deres anvendelighed i sygdomsmodeller med atrieflimren remodeling er begrænset.
I denne artikel, har vi implementeret en protokol til isolering af atrieflimren encellede cardiomyocytes fra dyr, der udviser atrieflimren remodeling (dvs, især for den ZFS1 rotte model for MetS-relaterede HFpEF)22. Eksisterende isolering protokoller blev optimeret og suppleret med en enkel, custom-made enhed til at kontrollere og ændre intraluminal presset af hjertets hulrum, fører til højere udbytter af morfologisk og funktionelt intakt cardiomyocytes. Følgende protokol giver forsker med en trinvis guide, en detaljeret beskrivelse af specialfremstillet udstyr, en liste over løsninger, samt en omfattende fejlfindingsvejledning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskrevet vi første gang en protokol til isolering af enkelt celle ACMs fra en rotte model af MetS-relaterede HFpEF der viser mærket atrieflimren remodeling22. Proceduren, der er entydigt udfordrende som overdreven fedtvæv kan gøre den kirurgiske forberedelse, samt cannulation af aorta, stadig vanskeligere. Guiden fejlfinding fastsat i tabel 2 adresser de mest almindelige spørgsmål af proceduren isolation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-w…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af DZHK (tyske Center for hjerte-kar-forskning, D.B.), EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), og af BMBF (tysk Ministeriet for uddannelse og forskning) samt BIH-Charité kliniske videnskabsmand program finansieret ved Charité – Universitätsmedizin Berlin, og Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
