בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר
Summary
כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.
Abstract
במאמר זה, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד פרפור cardiomyocytes (ACMs) ממודל עכברוש של תסמונת מטבולית (גרורות)-הקשורים אי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר (HFpEF). השכיחות של HFpEF הקשורות המטס עולה ולאחר פרפור cardiomyopathies הקשורים שיפוץ פרוזדורים פרפור פרוזדורים הן רלוונטיות קלינית גבוהה כמו שיפוץ פרוזדורים כמנבא עצמאית של התמותה. מחקרים עם cardiomyocytes תא בודד מבודדים משמשים לעתים קרובות לאמת ולהשלים ויוו ממצאים. Rarefication כלי הדם ואת רקמת ביניים פיברוזיס להוות גורם מגביל באופן פוטנציאלי לבידוד בתא יחיד מוצלחת של ACMs של מודלים חייתיים של מחלה זו.
פתרנו בעיה זו על-ידי הפעלת מכשיר המסוגל באופן ידני וויסות הלחץ intraluminal של חללים הלב במהלך ההליך בידוד, האריך את התשואה של ACMs מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע. התאים הנרכש ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים שונים, כגון תרבית תאים הדמיה תפקודית סידן (קרי, עירור-התכווצות-מצמד).
אנו מספקים החוקר עם פרוטוקול צעד אחר צעד, רשימה של פתרונות ממוטבים, הוראות יסודיות כדי להכין את כל הציוד הדרוש, מדריך מקיף לפתרון בעיות. בעוד היישום הראשוני של ההליך עשוי להיות קשה למדי, הסתגלות מוצלחת יאפשר לקורא לבצע את המדינה-of-the-art ACM ומשום במודל של עכברים של המטס הקשורות HFpEF עבור קשת רחבה של ניסויים.
Introduction
המטס מתאר מקבץ של גורמי סיכון סוכרת סוג 2, מחלות לב וכלי דם, כולל של לחץ דם עורקי מוגברת, dyslipidemia (העלה טריגליצרידים והנמכתי כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה), גדל צום גלוקוז, השמנה מרכזית1. השכיחות של גרורות ברחבי העולם מוערך 25 – 30% ובעלייה מתמדת2. HFpEF היא תסמונת קלינית heterogenous קשורה לעיתים קרובות עם גרורות. שיפוץ לב במהלך HFpEF, בשלבים הקודמים שלה (כלומר, מחלות לב לחץ דם גבוה) מלווה גם שיפוץ של אטריה3. הפונקציה כויץ מופחתת ושינויים מבניים של אטריום שמאל קושרו עם תמותה מוגברת, פרפור פרוזדורים, אי ספיקת לב התפרצות חדשה4. שיפוץ פרוזדורים מאופיין על ידי שינויים יון ערוץ פונקציה, Ca2 + הומאוסטזיס, מבנה פרוזדורים, פיברובלסט ההפעלה, וכן רקמות פיברוזיס5. עזבו שיפוץ פרוזדורים HFpEF הקשורות מטס, שבבסיס שלה מנגנונים פתולוגיים עדיין הם הבינו, דורשים חקירה מעמיקה עוד יותר. מודלים בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך, להוביל ופיתוחים בתחום של פרפור cardiomyopathies6,7,8,9.
מחקרים עם cardiomyocytes תא בודד מבודדים משמשים לעתים קרובות לאמת ולהשלים ויוו ממצאים. בידוד, התרבות תאים עוקבים פוטנציאליים, לאפשר החקירה של איתות המסלולים זרמי ערוץ יוניים, עירור-התכווצות-מצמד. בתנאים הפיזיולוגיות, cardiomyocytes לא להתרבות. המיזוג בין רצפי רגולטוריות גנים ברמת השעתוק גורם atrial natriuretic, וירוס קופיים 40 גדול T אנטיגן של העכברים הטרנסגניים הוביל ליצירתו של ACMs immortalized הראשונה, בשם AT-110. המשך ההתפתחות של תאים ב- 1 הולידה HL-1 תאים, אשר לא יכולים רק להיות באופן סדרתי passaged אבל גם חוזה באופן ספונטני11. הם, לעומת זאת, מראים הבדלים מבניים ופונקציונליים לעומת תאים מבודדים טרי, כמו ultrastructure פחות מאורגנים, מופע גבוהה של פיתוח myofibrils11, ו- מופעל hyperpolarization פנימה הנוכחי12. בידודו של חדרית cardiomyocytes (VCM) אצל חולדות ועכברים ממגוון רחב של דגמים הוא וותיקה13,14,15,16,17,18 , 19. בדרך כלל, הלב נכרת הוא רכוב על מנגנון Langendorff ו retrogradely perfused עם Ca2 +-חינם מאגר המכיל אנזימי עיכול, כגון collagenases, פרוטאזות. סידן ואז מופיעה שוב בצורה stepwise לכל התנאים הפיזיולוגיים. עם זאת, למרות הפרוטוקולים המוקדש בידודו של ACMs זמין20,21, בשל פיברוזיס מוגברת והבדלים הקשורות ללחץ, התועלת שלהם מחלת דגמים עם שיפוץ פרוזדורים מוגבל.
במאמר זה, יישמנו פרוטוקול עבור בידודו של פרפור cardiomyocytes תא בודד מחיות המציגים פרפור שיפוץ (קרי, במיוחד עבור דגם עכברוש ZFS1 עבור HFpEF הקשורות מטס)22. קיימים פרוטוקולים בידוד ממוטב, כהשלמה מכשיר פשוט, בהזמנה אישית לשליטה ולשינוי הלחץ intraluminal של חללים הלב, שמוביל תשואות גבוהות של cardiomyocytes מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע. להלן כללי התנהגות מספק החוקר עם מדריך צעד אחר צעד, תיאור מפורט של הציוד בהזמנה אישית, רשימה של פתרונות, כמו גם מדריך לפתרון בעיות מקיף.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו קודם תיאר עבור בידודו של תא בודד ACMs ממודל עכברוש של המטס הקשורות HFpEF המציגה מסומן שיפוץ פרוזדורים22פרוטוקול. הנוהל הוא ייחודי מאתגר כמו רקמות שומן עודף יכול לגרום ההכנה כירורגי, כמו גם את תעלות של אבי העורקים, יותר ויותר קשה. המדריך לפתרון בעיות מסופקים כתובות בטבל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי DZHK (גרמנית מרכז למחקר קרדיו, די. בי), EKFS (Stiftung אחרת-Kröner-Fresenius, F.H.), ועל -ידי את BMBF (משרד החינוך הגרמני, מחקר), כמו גם BIH-צ’אריטה במימון תוכנית מדען קליני מאת צ’אריטה – Universitätsmedizin ברלין, ברלין מכון הבריאות (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
