Isolement des Cardiomyocytes auriculaires d’un modèle de Rat de métaboliques liées Syndrome une insuffisance cardiaque avec Fraction d’éjection préservée
Summary
Ici, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des cardiomyocytes auriculaires cellule unique d’un modèle de rat de métabolique associés au syndrome d’une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée. Une régulation manuelle de la pression intraluminale des cavités cardiaques est mis en œuvre pour produire des myocytes fonctionnellement intactes adaptés aux études couplage excitation-contraction.
Abstract
Dans cet article, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des unicellulaires auriculaires cardiomyocytes (ACMs) d’un modèle de rat du syndrome métabolique (MetS)-liés à une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF). Augmente la prévalence de HFpEF axés sur les MetS et auriculaires cardiomyopathies associées de remodelage de l’auriculaire et fibrillation auriculaire sont cliniquement très pertinents comme transformant auriculaire est un facteur prédictif indépendant de mortalité. Des études avec des cardiomyocytes isolés unicellulaires sont fréquemment utilisés pour corroborer et compléter en vivo résultats. Raréfaction du vaisseau circulatoire et fibrose du tissu interstitiel constituent un facteur potentiellement limitatif pour l’isolement de cellule unique succès de ACMs de modèles animaux de cette maladie.
Nous avons abordé cette question en employant un dispositif capable de réguler manuellement la pression intraluminale des cavités cardiaques au cours de la procédure d’isolement, d’augmenter considérablement le rendement de l’ACMs morphologiquement et fonctionnellement intactes. Les cellules acquis peuvent être utilisés dans une variété de différentes expériences, telles que la culture cellulaire et l’imagerie fonctionnelle de Calcium (c.-à-d., couplage excitation-contraction).
Nous fournissons un protocole étape par étape, une liste de solutions optimisées, approfondies instructions pour préparer le matériel nécessaire et un guide de dépannage complet le chercheur. Bien que l’implémentation initiale de la procédure peut être assez difficile, une adaptation réussie permettra au lecteur d’effectuer des isolations de ACM state-of-the-art dans un modèle de rat de HFpEF MetS liés pour un large éventail d’expériences.
Introduction
MetS décrit un ensemble de facteurs de risque de maladies cardiovasculaires et le diabète type 2 et comprend une augmentation tension artérielle, dyslipidémie (originaire de triglycérides et réduit le cholestérol des lipoprotéines de haute densité), augmenté de jeûne glucose et l’obésité centrale1. La prévalence dans le monde entier des MetS est estimée à 25 – 30 % et constante augmentation2. HFpEF est un syndrome clinique hétérogène, souvent associé aux MetS. Le remodelage cardiaque au cours de la HFpEF et ses phases précédentes (c’est-à-dire, cardiopathie hypertensive) est également accompagné d’un remodelage des oreillettes3. Contractilité réduite et des changements structurels de l’oreillette gauche ont été associés à une mortalité accrue, la fibrillation auriculaire et insuffisance cardiaque-apparition4. Remodelage de l’auriculaire se caractérise par des changements dans la fonction de canal d’ion, l’homéostasie de Ca2 + , structure auriculaire, activation de fibroblastes et de fibrose tissulaire5. Laissé remodelage auriculaire chez HFpEF axés sur les MetS et ses sous-jacent mécanismes pathologiques sont encore mal comprises et nécessitent une complément d’enquête approfondie. Modèles animaux se sont avérés être un outil précieux et conduire à nombreuses avancées dans le domaine des cardiomyopathies auriculaire6,7,8,9.
Des études avec des cardiomyocytes isolés unicellulaires sont fréquemment utilisés pour corroborer et compléter en vivo résultats. Un isolement et culture cellulaire ultérieure éventuelle, permettent pour l’étude de la signalisation des voies et courants des canaux ioniques-couplage excitation-contraction. Dans des conditions physiologiques, les cardiomyocytes ne prolifèrent pas. La fusion entre les séquences régulatrices transcriptionnelles du facteur natriurétique auriculaire et un antigène T grand 40 virus simien chez la souris transgéniques a conduit à la création de l’ACMs immortalisés premiers, nommé AT-110. La poursuite du développement des cellules AT-1 a donné naissance à des cellules HL-1, qui ne peut pas seulement être repiquées en série, mais également des ententes contractuelles spontanément11. Ils font, cependant, montrent des différences structurales et fonctionnelles par rapport à des cellules fraîchement isolées, comme une ultrastructure moins organisé, une fréquence élevée de myofibrilles11et un courant entrant activés par une hyperpolarisation12. L’isolement des cardiomyocytes ventriculaires (VCM) chez les rats et les souris d’une variété de modèles est bien établi13,14,15,16,17,18 , 19. en règle générale, le cœur excisé est monté sur un appareil de Langendorff et marqués perfusé avec un Ca2 +-tampons libres contenant des enzymes digestives, telles que des collagénases et des protéases. Calcium est ensuite réintroduit de façon progressive aux conditions physiologiques. Cependant, même si les protocoles dédiés à l’isolement de l’ACMs sont disponible20,21, en raison d’une augmentation de la fibrose et les différences liées à la pression, leur utilité dans les modèles de maladies avec remodelage auriculaire est limitée.
Dans cet article, nous avons mis en place un protocole pour l’isolement des auriculaires unicellulaires cardiomyocytes provenant d’animaux qui montrent auriculaire retouche (c’est-à-dire, en particulier pour le modèle de rat de ZFS1 pour HFpEF axés sur les MetS)22. Des protocoles d’isolement existant ont été optimisées et complétées par un dispositif simple, sur mesure, de contrôler et de modifier la pression intraluminale des cavités cardiaques, conduisant à des rendements plus élevés des cardiomyocytes morphologiquement et fonctionnellement intactes. Le protocole suivant fournit le chercheur avec un guide étape par étape, une description détaillée de l’équipement sur mesure, une liste de solutions, ainsi que d’un guide de dépannage complet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons tout d’abord décrit un protocole pour l’isolement de l’ACMs cellule unique d’un modèle de rat de MetS liés HFpEF qui montre marqué auriculaire retouche22. La procédure est particulièrement difficile car l’excès de tissu graisseux peut faire la préparation chirurgicale, ainsi que la canulation de l’aorte, de plus en plus difficile. Le guide de dépannage fourni dans le tableau 2 adresses les questions les plus courantes de la technique d’isolat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire, D.B.), le EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) et par le BMBF (ministère allemand de l’éducation et la recherche), ainsi que la Bosnie-Herzégovine-Charité cliniciens programme financé de la Charité – Universitätsmedizin Berlin et l’Institut de santé de Berlin (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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