保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから心房の心筋細胞の単離
Summary
ここでは、保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから単一セル心房心筋細胞を分離するため、蛍光ベースの最適化手順をについて説明します。心腔の内圧の手動調節、機能そのまま心筋興奮収縮連関研究に適した屈する実装されます。
Abstract
この記事で述べるメタボリック シンドローム (メッツ) のモデルラットから単一セル心房心筋細胞 (Acm) を分離するため、蛍光ベースの最適化手順-保存された駆出分画 (HFpEF) で心不全の関連。メッツ関連 HFpEF の有病率が上昇していると心房リモデリングと心房細動に関連する心房の心筋症は、心房を改造死亡率の独立した予測因子である関連性の高い臨床的に。隔離された単一細胞心筋細胞を用いた研究が確証し、生体内で調査結果を補完するためによく使用されます。循環容器 rarefication と間質性組織線維化は、この病気の動物モデルからの ACMs の成功単一セル隔離の可能性のある制限要因をもたらします。
我々 は形態および機能そのまま ACMs の収量が大幅に増加手動で分離している最中、心臓腔内圧を調整する装置を採用することによりこの問題を解決しました。取得した細胞はさまざまな細胞培養、機能カルシウム イメージング (すなわち、興奮収縮連関) など、別の実験で使用できます。
順を追ってプロトコル最適化されたソリューションは、包括的なトラブルシューティング ガイドと必要な機器を準備する徹底した指示のリストと研究者を提供します。プロシージャの最初の実装は難しいかもしれないの成功の適応はメッツ関連 HFpEF 実験の広いスペクトルのためのモデルラットの新式の ACM 隔離を実行するリーダーになります。
Introduction
メッツ タイプ 2 糖尿病と心血管疾患のリスク要因のクラスターをについて説明し、増加動脈血圧高脂血症 (トリグリセリドの発生し、高密度リポタンパク質コレステロールを下げる)、増加断食グルコースおよび中心性肥満1。メッツの世界的な有病率は 25-30% になり、絶えず上昇2と推定されます。HFpEF はメッツにしばしば関連付けられている異種臨床症候群です。HFpEF と (すなわち、高血圧性心臓病) その前の段階の間に心筋のリモデリング心房3の改造伴われるも。減らされた収縮機能および左心房の構造的変化は、死亡率の増加、心房細動新規発症の心不全4と関連しています。心房リモデリングはイオン チャネル機能、Ca2 +恒常性、心房の構造、線維芽細胞の活性化と組織の線維化5の変化によって特徴付けられます。左心房改造メッツ関連 HFpEF とその基礎となる病理学的メカニズムはまだよくわかっていないし、さらに詳細な調査が必要です。動物モデルは、貴重なツールになるし、心房の心筋症6,7,8,9の分野で多くの進歩をもたらすと証明しました。
隔離された単一細胞心筋細胞を用いた研究が確証し、生体内で調査結果を補完するためによく使用されます。分離、および潜在的なそれに続く細胞培養、シグナル伝達経路, イオン チャネル電流と興奮収縮連関の調査を可能にします。生理学的な条件の下で心筋細胞は増殖しません。心房性 na 利尿因子の転写制御配列と、シミアン ウイルス 40 large T 抗原遺伝子導入マウスの融合は、AT 110の名前最初の不死化 ACMs の作成をもたらした。AT 1 細胞のそれ以上の開発は HL 1 セルのみ連続継代できませんがまた11を自発的に契約をもたらした。ただし、に比べてあまり組織的微細構造、筋原繊維の11、および過分極側に内側現在12開発の頻度が高いなどの新鮮単離細胞構造および機能に違いを示す彼らは。ラットおよびマウスの様々 なモデルからの心室心筋細胞 (VCM) の分離が確立13,14,15,16,17,18,19します。 一般的に、摘出心臓は蛍光装置に取り付け、Ca2 +による逆行性に灌流-コラーゲンやプロテアーゼなどの消化酵素を含む空きバッファー。カルシウムは生理学的条件を段階的に再導入し。しかし、ACMs の分離に専用プロトコルが利用可能な20,21, 線維の増加と圧力差による心房リモデリングと疾患モデルの有用性は限られています。
この記事で心房改造 (すなわち、特にメッツ関連 HFpEF の ZFS1 ラット モデル)22動物から心房の単一細胞心筋細胞の隔離のためのプロトコルを実装しています。既存の隔離のプロトコル最適化、制御、形態および機能そのまま心筋細胞のより高い収穫につながる心の空洞の内圧を修正する簡単な特注デバイスによって補完されます。次のプロトコルは、研究者のステップ バイ ステップ ガイド、カスタムメイド機器ソリューションのリスト、包括的なトラブルシューティング ガイドの詳細な説明を提供します。
Protocol
すべての実験は (TVA T0060/15 と T0003 15) ローカル倫理委員会で承認され、ケアと実験動物の使用 (国立衛生研究所、米国) のためのガイドラインと一致して実行します。 注: プロシージャの簡易フローチャートは、図 1に示すです。 1. 雛形 表 1 に従ってバッファーを準備します。 <table border="1" fo:keep-togeth…
Representative Results
生後 21 週、実行可能な ACMs (6.1 のステップに従って推定)、カルシウム再適応 (ステップ 5.4-5.7) 後の 60-90% は、このメソッド (図 4 a) によって ZSF 1 肥満ラットから分離できます。ラット、ACMs VCMs24,25と比較してより多くの異種表現型と異なる特徴です。図 4 bは、保存状態の膜およ?…
Discussion
ここでは、我々 はまずメッツ関連 HFpEF 示す心房改造22をマークのモデルラットから単一セル ACMs の隔離のためのプロトコルを説明します。手順は、過剰な脂肪組織はますます困難な大動脈カニュレーションと同様、手術の準備をすることができます一意に挑戦です。トラブルシューティング ガイドは、表 2アドレス分離のプロシージャの最も一般的な問題です?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は DZHK (ドイツ語マッシィ心血管研究センター)、によって支えられた (Else Kröner フレゼニウス財団、f. H.) EKFS、BMBF (ドイツ語教育省および研究) と臨床科学者プログラム資金 BIH シャリテによってシャリテ – Universitätsmedizin ベルリン、ベルリン衛生研究所 (f. H.)。
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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Cite This Article
Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., Heinzel, F. R., Hohendanner, F. Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction. J. Vis. Exp. (137), e57953, doi:10.3791/57953 (2018).