Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada
Summary
Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.
Abstract
En este artículo describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos atrial unicelular (ACMs) de un modelo de rata de síndrome metabólico (MetS)-relacionados con la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP). Está aumentando la prevalencia de ICFEP relacionadas con MetS y aurículas miocardiopatías asociadas con remodelado auricular y fibrilación auricular son clínicamente muy relevantes como remodelado auricular es un predictor independiente de mortalidad. Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Enrarecimiento de vasos circulatorios y fibrosis del tejido intersticial constituyen un factor potencialmente limitante para el aislamiento exitoso de unicelular de ACMs de modelos animales de esta enfermedad.
Hemos abordado este problema mediante el empleo de un dispositivo capaz de regular manualmente la presión intraluminal de las cavidades cardíacas durante el procedimiento de aislamiento, incrementar sustancialmente el rendimiento de ACMs morfológicamente y funcionalmente intactas. Las células adquiridas pueden utilizarse en una variedad de diferentes experimentos, como el cultivo celular y funcional proyección de imagen de calcio (es decir, excitación-contracción-acoplamiento).
Proporcionamos el investigador con un protocolo paso a paso, una lista de soluciones optimizadas, completa instrucciones para preparar el equipo necesario y una guía completa de la solución de problemas. Mientras que la aplicación inicial del procedimiento puede ser bastante difícil, una exitosa adaptación permitirá al lector realizar aislamientos de ACM de vanguardia en un modelo de rata de ICFEP relacionadas con MetS para un amplio espectro de experiencias.
Introduction
MetS describe un conjunto de factores de riesgo para enfermedad cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2 e incluye una mayor tensión arterial, dislipemia (elevado los triglicéridos y bajar el colesterol de lipoproteína de alta densidad), mayor ayuno glucosa y obesidad central1. La prevalencia mundial de MetS se estima que 25-30% y constantemente el aumento de2. ICFEP es un síndrome clínico heterogéneo, a menudo asociado con los MetS. La remodelación cardiaca durante sus fases anteriores (es decir, enfermedad cardíaca hipertensiva) e ICFEP también es acompañada por una remodelación de las aurículas3. Reduce la función contráctil y cambios estructurales de la aurícula izquierda se han asociado con aumento de la mortalidad, la fibrilación auricular y la insuficiencia cardíaca de nueva aparición4. Remodelación atrial se caracteriza por cambios en la función de canal de iones, homeostasis de Ca2 + , la estructura, activación de fibroblastos y tejido fibrosis5. Remodelación atrial en ICFEP relacionadas con los MetS y su subyacente mecanismos patológicos son todavía poco conocidos y requieren una investigación más a fondo a la izquierda. Modelos animales han demostrado ser una herramienta valiosa y dar lugar a muchos avances en el campo de la miocardiopatías6,7,8,9.
Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Aislamiento y cultivo celular subsecuente potencial, permiten la investigación de la señalización de caminos, corrientes de canal iónico y excitación-contracción-acoplamiento. En condiciones fisiológicas, no proliferan los cardiomiocitos. La fusión entre las secuencias de regulación transcripcionales de factor natriurético atrial y un antígeno de T grande de virus de los simios 40 en ratones transgénicos llevó a la creación de las primera ACMs inmortalizados, denominado AT-110. El desarrollo de las células en-1 dio lugar a las células HL-1, que sólo pueden ser pasadas en serie pero también espontáneamente contratación11. , Sin embargo, presentan diferencias estructurales y funcionales en comparación con las células recién aisladas, como una ultraestructura menos organizada, una alta ocurrencia de desarrollo de miofibrillas11y una hiperpolarización-activado hacia adentro de la corriente12. El aislamiento de los cardiomiocitos ventriculares (VCM) en ratas y ratones de una variedad de modelos es bien establecida13,14,15,16,17,18 , 19. en general, el corazón suprimido es montado en un aparato Langendorff y retrogradely inundado con un Ca2 +-libre tampón que contiene enzimas digestivas, tales como colagenasas y proteasas. Calcio es entonces reintroducido de forma gradual a las condiciones fisiológicas. Sin embargo, aunque protocolos dedicados al aislamiento de ACMs están disponibles20,21, debido al aumento de la fibrosis y diferencias de presión, su utilidad en modelos de enfermedades con el remodelado auricular es limitada.
En este artículo, hemos implementado un protocolo para el aislamiento de la cardiomiocitos unicelular de los animales que muestran la remodelación (es decir, en particular para el modelo de rata ZFS1 relacionadas con MetS ICFEP)22. Los protocolos de aislamiento optimizados y complementados con un dispositivo simple, a la medida para controlar y modificar la presión intraluminal de las cavidades cardiacas, conduciendo a producciones más altas de cardiomiocitos morfológicamente y funcionalmente intactas. El siguiente protocolo proporciona al investigador una guía paso a paso, una descripción detallada de los equipos a medida, una lista de soluciones, así como una guía completa de la solución de problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, primero descrito un protocolo para el aislamiento de ACMs unicelular de un modelo de rata de MetS relacionadas con ICFEP que muestra marcada remodelación auricular22. El procedimiento es único desafiante como el exceso de tejido graso puede hacer la preparación quirúrgica, así como la canulación de la aorta, cada vez más difícil. La guía de solución de problemas proporcionados en las direcciones de la tabla 2 los problemas más comunes del procedimiento de aislami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el DZHK (centro alemán de Investigación Cardiovascular, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) y por el BMBF (Ministerio alemán de educación e investigación), así como Bosnia y Herzegovina-Charité financiado por el programa científico de la clínica por la Charité – Universitätsmedizin de Berlín y el Instituto de salud del estado de Berlín (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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