Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu
Summary
Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.
Abstract
Bu makalede, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı tek hücreli atriyal cardiomyocytes (ACMs) bir fare modeli Metabolik sendromu (MetS) yalıtım için açıklayınız-kalp yetmezliği korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile ilgili. MetS ile ilgili HFpEF yaygınlığı artıyor ve atriyal remodeling mortalite bağımsız bir tahmin olarak atriyal kardiyomiyopatiler atriyal remodeling ve atriyal fibrilasyon ile ilgili klinik olarak son derece ilgilidir. Çalışmalar izole tek hücreli cardiomyocytes ile teyit ve in vivo bulgular tamamlayıcı için sık sık kullanılır. Dolaşım gemi rarefication ve interstisyel doku fibrozu ACMs başarılı tek hücreli yalıtım bu hastalığın hayvan modeller için potansiyel olarak kısıtlayıcı bir faktör poz.
Biz bu sorunu bir aygıtı el ile yalıtım işlem sırasında kalp boşlukları intraluminal basınç düzenleyen yetenekli istihdam ederek önemli ölçüde morfolojik ve fonksiyonel olarak sağlam ACMs verimini artırma ele sahip. Alınan hücreler, hücre kültürü ve fonksiyonel kalsiyum görüntüleme (yani, uyarma-kasılma-kaplin) gibi farklı deneyler çeşitli kullanılabilir.
Araştırmacı bir adım adım protokolüyle, listesini en iyi duruma getirilmiş çözümler, gerekli ekipman ve kapsamlı sorun giderme Rehberi hazırlamak için ayrıntılı yönergeler sağlar. Yordamın ilk uygulama oldukça zor olabilir, başarılı bir uyum okuyucu MetS ile ilgili HFpEF deneyler geniş bir yelpazede, fare modeli state-of–art ACM izolasyonların gerçekleştirmek izin verir.
Introduction
MetS tip-2 diyabet ve kalp-damar hastalıkları için risk faktörlerinin bir küme tanımlar ve artan bir arteryel kan basıncı içerir (trigliserid yükseltilmiş ve alçaltılmış yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol) dislipidemi, artan açlık glikoz ve merkezi obezite1. MetS dünya çapında yaygınlık % 25-30 ve sürekli yükselen2olduğu tahmin edilmektedir. HFpEF hànzú bir klinik sendrom genellikle MetS ile ilgili olduğunu. HFpEF ve onun önceki aşamaları (yani, hipertansif kalp hastalığı) sırasında kalp remodeling da kulakçık3/ remodeling tarafından eşlik eder. İndirimli contractile işlevi ve sol atriyum yapısal değişiklikler artmış mortalite, atriyal fibrilasyon ve yeni başlangıçlı kalp yetmezliği4ile ilişkili bulunmuştur. Atriyal remodeling iyon kanal işlevi, Ca2 + homeostazı, atriyal yapısı, fibroblast harekete geçirmek ve doku fibrozu5değişiklikler karakterizedir. Atriyal MetS ile ilgili HFpEF ve onun altında yatan patolojik mekanizmaları hala kötü anlaşılır ve bir daha da derinlemesine araştırma gereken remodeling için yorum yaptı. Hayvan modelleri var olmak a değerli alet ve atriyal kardiyomiyopatiler6,7,8,9alanında birçok gelişmeler yol kanıtlanmıştır.
Çalışmalar izole tek hücreli cardiomyocytes ile teyit ve in vivo bulgular tamamlayıcı için sık sık kullanılır. Bir izolasyon ve potansiyel sonraki hücre kültürü, yollar, iyonik kanal akımları ve uyarma-kasılma-kaplin sinyal soruşturma için izin verir. Fizyolojik koşullar altında cardiomyocytes çoğalırlar değil. Füzyon bir atrial natriuretic faktör transkripsiyon düzenleyici dizisi ve bir simian virüs 40 büyük T antijen transgenik farelerde arasında AT-110adlı ilk ölümsüzleştirdi ACMs yol açtı. AT-1 hücreleri daha da geliştirilmesi sadece seri olarak passaged edemem ama aynı zamanda kendiliğinden sözleşme11HL-1 hücrelere doğuran. Ancak, daha az organize ultrastructure myofibrils11ve bir hyperpolarization harekete geçirmek içe geçerli12geliştirme yüksek bir olay gibi taze izole hücrelere kıyasla yapısal ve işlevsel farklılıklar göstermektedir. Ventrikül cardiomyocytes (VCM) sıçanlar ve fareler modelleri çeşitli yalıtım iyi kurulmuş13,14,15,16,17,18 ‘ dir , 19. genel olarak eksize kalp Langendorff aparatı monte ve retrogradely bir Ca2 +ile derin-collagenases ve proteaz gibi sindirim enzimleri içeren boş arabellek. Kalsiyum o zaman fizyolojik şartlarda kademeli bir şekilde yeniden ortaya çıkar. Ancak, kullanışlılığı hastalık modelleri atriyal remodeling ile sınırlı olmasına rağmen ACMs yalıtım için adanmış protokolleri kullanılabilir20,21, artan fibrozis ve basınç ilgili farklar nedeniyle.
Bu makalede, bir protokol atriyal remodeling (yani, özellikle ZFS1 fare modeli MetS ile ilgili HFpEF için)22göstermek hayvanlardan atriyal tek hücreli cardiomyocytes yalıtım için hayata geçirdik. Varolan yalıtım protokolleri en iyi duruma getirilmiş ve kontrol ve morfolojik ve fonksiyonel olarak sağlam cardiomyocytes daha yüksek verimleri için önde gelen kardiyak boşluklar, intraluminal basınç değiştirmek için basit, özel yapım bir aygıt tarafından tamamlanmaktadır. Aşağıdaki iletişim kuralı bir adım adım kılavuz ile araştırmacı, özel yapım donanımları, bir liste-in eriyik yanı sıra kapsamlı sorun giderme kılavuzu ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, ilk tek hücreli ACMs atriyal remodeling22işaretlenmiş gösteren MetS ile ilgili HFpEF bir fare modeli yalıtım için bir protokol açıklanan. Aşırı yağ dokusu aort, giderek daha zor cannulation yanı sıra cerrahi hazırlık yapabilir gibi benzersiz olarak zor bir işlemdir. Sorun giderme kılavuzu Tablo 2 adresleri yalıtım yordam en yaygın sorunların sağlanan.
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
