Isolering av Atrial Cardiomyocytes fra en rotte modell av Metabolsk syndrom-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøk
Summary
Her beskriver vi en optimalisert, Langendorff-baserte prosedyre for isolering av encellede atrial cardiomyocytes fra en rotte modell av Metabolsk syndrom-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøkdel. En manuell regulering av intraluminal presset av cardiac hulrom er gjennomført for å gi funksjonelt intakt myocytter egnet for eksitasjon-sammentrekning-kopling studier.
Abstract
I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert, Langendorff-baserte prosedyre for isolering av encellede atrial cardiomyocytes (ACMs) fra en rotte modell av Metabolsk syndrom (MetS)-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøkdel (HFpEF). Utbredelsen av MetS-relaterte HFpEF stiger, og atrial cardiomyopathies forbundet med atrial remodeling og atrieflimmer er klinisk svært relevante atrial remodeling er en uavhengig prediktor for dødelighet. Studier med isolert encellede cardiomyocytes brukes ofte til å bekrefte og utfyller i vivo funn. Sirkulasjons fartøy rarefication og interstitielle vevet fibrose utgjør en potensielt begrensende faktor for vellykket encellede isolering av ACMs fra dyr modeller av denne sykdommen.
Vi har adressert dette problemet ved å bruke en enhet i stand til å manuelt regulere intraluminal trykket av cardiac hulrom under isolasjon prosedyren, vesentlig øke avkastningen av morphologically og funksjonelt intakt ACMs. Ervervet cellene kan brukes i en rekke forskjellige eksperimenter, som cellekultur og funksjonell kalsium imaging (dvs., eksitasjon-sammentrekning-kobling).
Vi gir en trinnvis protokoll, en liste over Optimaliserte løsninger, nøyaktige instruksjoner å forberede nødvendig utstyr og en omfattende feilsøkingsguiden forskeren. Mens den første implementeringen av prosedyren kan være ganske vanskelig, la en vellykket tilpasning leseren til å utføre state-of-the-art ACM isolasjoner i en rotte modell av MetS-relaterte HFpEF for et bredt spekter av eksperimenter.
Introduction
MetS beskriver en klynge av risikofaktorer for diabetes mellitus type 2 og hjerte-og karsykdommer og inkluderer en økt arterial blodtrykket, dyslipidemi (hevet triglyserider og senket high-density lipoprotein kolesterol), økte faste glukose og sentral fedme1. Verdensomspennende utbredelsen av MetS er anslått til 25-30% og stadig stigende2. HFpEF er et heterogene klinisk syndrom ofte assosiert med MetS. Cardiac remodeling under HFpEF og foregående faser (dvs., Hypertensiv hjertesykdom) er også ledsaget av en ombygging av atria3. Redusert kontraktile funksjon og strukturelle endringer av venstre atrium har vært assosiert med økt dødelighet og atrieflimmer nye hjertesvikt4. Atrial remodeling er preget av endringer i kanalen Ionefunksjonen, Ca2 + homeostase, atrial strukturen, fibroblast aktivisering og vev fibrose5. Venstre atrial remodeling i MetS-relaterte HFpEF og dens underliggende patologisk mekanismer er fremdeles dårlig forstått og krever en mer dyptgående undersøkelse. Dyremodeller har vist seg å være et verdifullt verktøy og føre til mange fremskritt innen atrial cardiomyopathies6,7,8,9.
Studier med isolert encellede cardiomyocytes brukes ofte til å bekrefte og utfyller i vivo funn. En og den potensielle påfølgende cellekultur, tillater etterforskningen signalnettverk trasé ioniske kanal strømninger og eksitasjon-sammentrekning-kobling. Under fysiologiske forhold, cardiomyocytes ikke sprer. Fusjonen mellom transcriptional regulatoriske sekvenser av en atrial natriuretic faktor og en simian virus 40 store T antigen hos transgene mus førte til etableringen av de første udødeliggjort ACMs, navnet på-1-10. Videre utvikling av AT-1 celler ga opphav til HL-1 celler, som ikke bare være serielt passaged men også kontrakt spontant11. De gjøre, men viser strukturelle og funksjonelle forskjeller sammenlignet med fersk isolert celler, for eksempel en mindre organisert ultrastructure, en høy forekomst av utvikle myofibrils11og en hyperpolarization-aktivert innover gjeldende12. Isolasjon av ventrikkel cardiomyocytes (VCM) i rotter og mus fra en rekke modeller er godt etablert13,,14,,15,,16,,17,,18 , 19. vanligvis forbrukeravgift hjertet er montert til en Langendorff apparater og retrogradely parfyme med en Ca2 +-gratis bufferen som inneholder fordøyelsesenzymer, som collagenases og proteaser. Kalsium er deretter gjeninnføres på en gradvis måte fysiologiske forhold. Men selv om protokollene dedikert til isolering av ACMs er tilgjengelig20,21, økt fibrose og trykk forskjeller, er nytten i sykdom modeller med atrial remodeling begrenset.
I denne artikkelen har vi implementert en protokoll for isolering av atrial encellede cardiomyocytes fra dyr som viser atrial remodeling (dvs., særlig for ZFS1 rotte modell for MetS-relaterte HFpEF)22. Eksisterende isolasjon protokoller var optimalisert og supplert med en enkel, skreddersydde enhet å kontrollere og endre intraluminal trykket av cardiac hulrom, fører til høyere avkastning av morphologically og funksjonelt intakt cardiomyocytes. Følgende protokollen gir forsker med trinnvise instruksjoner, en detaljert beskrivelse av skreddersydde utstyret, en liste over løsninger, samt en omfattende feilsøkingsguiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrevet vi først en protokoll for isolering av encellede ACMs fra en rotte modell av MetS-relaterte HFpEF som viser merket atrial remodeling22. Prosedyren er unikt utfordrende som overdreven fettvev kan gjøre kirurgisk utarbeidelse, i tillegg til cannulation av aorta, stadig vanskeligere. Feilsøkingsinformasjonen gitt i tabell 2 adresser de vanligste problemene av isolasjon prosedyren.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="a…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av DZHK (tysk Centre for hjerte forskning, DB), EKFS (Else-Kröner-Fresenius-Stiftung, F.H.) og BMBF (tysk departementet for utdanning og forskning), samt BIH-Charité klinisk forsker programmet finansiert ved Charité – Universitätsmedizin Berlin og Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
