In Vitro Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi
Summary
Vi beskriver metoder til at isolere canine neutrofiler fra fuldblod og visualisere netto dannelse i live neutrofiler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Også beskrevet er protokoller at kvantificere netto dannelse og citrullinated Histon H3 (citH3) udtryk ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi.
Abstract
Som reaktion på invaderende patogener, frigive neutrofiler neutrofile ekstracellulære fælder (net), som er ekstracellulære netværk af DNA dekoreret med histoner og antimikrobiel proteiner. Overdreven netto dannelse (NETosis) og citH3 udgivelse under sepsis er forbundet med flere funktionsforstyrrelser og dødelighed i mus og mennesker, men dens konsekvenser i hunde er ukendt. Heri, beskriver vi en teknik til at isolere canine neutrofiler fra fuldblod for observation og kvantificering af NETosis. Leukocyt-rich plasma, genereret af dextran sedimentering, er adskilt af kommercielt tilgængelige tæthed gradient adskillelse medier og granulocytter indsamlet celle antal og levedygtighed afprøvning. For at overholde real-time NETosis i live neutrofiler, føjes celle permeant og celle impermeant fluorescerende nukleinsyre pletter til neutrofiler aktiveret enten af LPS (LPS) eller phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA). Ændringer i nukleare morfologi og netto dannelse er observeret over tid af Fluorescens mikroskopi. In vitro NETosis er yderligere karakteriseret ved co-colocalization af celle-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) og citrullinated Histon H3 (citH3) bruger en modificeret dobbelt-immunolabelling protokol. For at objektivt kvantificere netto dannelse og citH3 udtryk ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, redskaber og citH3-positive celler er kvantificeret i en blindet måde ved hjælp af tilgængelige software. Denne teknik er en specifik assay til at evaluere in vitro- kapaciteten af canine neutrofiler til at gennemgå NETosis.
Introduction
Neutrofiler er kortlivede granulocytter ansvarlig for den indledende forsvar mod invaderende patogener. Neutrofiler, rekrutteret til infektionsstedet, fjerne mikroorganismer ved fagocytose, degranulering og generation af reaktive ilt arter (ROS)1. Bakterier eller endotoksiner dekoreret neutrofiler release neutrofile ekstracellulære fælder (net), sammensat af ekstracellulære kromatin med histoner og granulerede proteiner som elastase og myeloperoxidase (MPO)2. Selv om NETs har uundværlig antimikrobielle egenskaber, tyder øge eksperimentel og klinisk dokumentation på, at nidkære netto dannelse under sepsis kan føre til flere organ dysfunktion og død3,4, 5 , 6.
Fordi net kan spille en lignende patofysiologiske rolle i hunde, kan terapeutiske indgreb, der enten forhindre eller mindske netto dannelse tjene som roman behandling strategier i septisk dyr. Derfor er der behov for en pålidelig teknik til at vurdere og bestemme NETosis og netto komponenter i hunde. NETTO komponenter, herunder celle-gratis DNA (cfDNA) og nucleosomes er tidligere blevet evalueret i canine neutrofile og plasma fra kliniske hunde7,8,9. Ved hjælp af fluorescens assays, fundet Goggs og Letendre at septisk hunde have højere niveauer af cfDNA end sunde hunde8. Selv om disse teknikker er meget objektive og kvantitative, er måling af cfDNA og nucleosomes som markører for NETosis uspecifikke, da de kan være afledt af nekrotiske celler end NETosing neutrofiler. Her beskriver vi en teknik, der udnytter Fluorescens mikroskopi for at undersøge adfærd af levende NETosing neutrofiler. Vi detalje også en modificeret protokol bruger dobbelt-immunolabeling til subjektivt kvantificere redskaber og deres komponenter såsom MPO og citH3 i canine neutrofiler10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her en protokol for at observere ændringer i kerner kropsbygning og cfDNA udgivelse i levende canine neutrofiler ved hjælp af både en celle permeant farvestof og en celle impermeant farvestof. Den største fordel ved denne analyse er, at det giver mulighed for real-time detektering af netto dannelsen af høj opløsning mikroskopi i live neutrofiler uden celle fiksering, derfor, at give et simpelt og værdifuldt redskab for observation i vitro netto dannelse. Da denne analyse ikke kræver antis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tilsvarende forfatteren blev finansieret af Morris Animal Foundation (D15CA-907). Undersøgelsen blev støttet af midler fra University of California, Davis, Center for Equine sundhed og Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Forfatterne vil gerne anerkende Geena Ng for hendes hjælp med tal og Nghi Nguyen for hendes hjælp med videoen.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
