इन विट्रो में कुत्ते न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
हम पूरे रक्त से कुत्ते न्यूट्रोफिल को अलग करने और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग लाइव न्यूट्रोफिल में शुद्ध गठन कल्पना करने के लिए तरीकों का वर्णन । यह भी वर्णित प्रोटोकॉल के लिए शुद्ध गठन और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं ।
Abstract
रोगजनकों पर हमला करने के जवाब में, न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), जो histones और रोगाणुरोधी प्रोटीन के साथ सजाया डीएनए के extracellular नेटवर्क हैं । अत्यधिक शुद्ध गठन (NETosis) और पूति के दौरान citH3 रिहाई चूहों और मनुष्यों में कई अंग रोग और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन कुत्तों में इसके निहितार्थ अज्ञात हैं । इस के साथ साथ, हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए पूरे रक्त से प्रेक्षण और NETosis के ठहराव के लिए कुत्ते न्यूट्रोफिल अलग । ल्युकोसैट-रिच प्लाज्मा, dextran अवसादन द्वारा उत्पंन, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल जुदाई मीडिया और सेल गिनती और व्यवहार्यता परीक्षण के लिए एकत्र granulocytes द्वारा अलग है । लाइव न्यूट्रोफिल में रीयल-टाइम NETosis का निरीक्षण करने के लिए, सेल permeant और सेल impermeant फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग को न्यूट्रोफिल (lipopolysaccharide) या एलपीएस 12-phorbol 13-myristate (पमा) द्वारा या तो सक्रिय करने के लिए जोड़ा जाता है । परमाणु आकृति विज्ञान और शुद्ध गठन में परिवर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा समय के साथ मनाया जाता है । इन विट्रो में NETosis आगे कोशिका मुक्त डीएनए (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) एक संशोधित डबल-immunolabelling प्रोटोकॉल का उपयोग कर के सह-colocalization द्वारा विशेषता है । शुद्ध गठन और citH3 अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जाल और citH3-सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक अंधा तरीके से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर quantified हैं । इस तकनीक को एक विशिष्ट परख के लिए इन विट्रो में कुत्ते न्यूट्रोफिल की क्षमता का मूल्यांकन NETosis से गुजरना है ।
Introduction
न्यूट्रोफिल कम रहते है granulocytes हमलावर रोगजनकों के खिलाफ प्रारंभिक सुरक्षा के लिए जिंमेदार है । न्यूट्रोफिल, संक्रमण की साइट के लिए भर्ती, phagocytosis, दानेदार, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS)1की पीढ़ी द्वारा सूक्ष्मजीवों को खत्म । बैक्टीरिया या endotoxins की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), extracellular और क्रोमेटिन और histones (elastase)2की तरह दानेदार प्रोटीन के साथ सजाया myeloperoxidase से बना । हालांकि जाल अपरिहार्य रोगाणुरोधी गुण है, बढ़ती प्रयोगात्मक और नैदानिक सबूत पता चलता है कि पूति के दौरान अति उत्साही शुद्ध गठन कई अंग रोग और मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं3,4, 5 , 6.
क्योंकि जाल कुत्तों में एक समान pathophysiological भूमिका निभा सकता है, चिकित्सीय हस्तक्षेप है कि या तो रोकने या कम शुद्ध गठन सेप्टिक जानवरों में उपंयास उपचार रणनीतियों के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस कारण से, वहाँ एक विश्वसनीय तकनीक का आकलन करने के लिए और कुत्तों में NETosis और शुद्ध घटकों का अंदाजा लगाने के लिए की जरूरत है । सेल सहित नेट अवयव मुक्त डीएनए (cfDNA) और nucleosomes पहले कुत्ते न्यूट्रोफिल और प्लाज्मा में नैदानिक कुत्तों7,8,9से मूल्यांकन किया गया है । प्रतिदीप्ति परख, Goggs और Letendre का उपयोग कर पाया कि सेप्टिक कुत्तों से cfDNA के उच्च स्तर है स्वस्थ8कुत्तों । हालांकि इन तकनीकों का अत्यधिक उद्देश्य और मात्रात्मक, NETosis के मार्कर के रूप में cfDNA और nucleosomes की माप गैर विशिष्ट है, क्योंकि वे NETosing न्यूट्रोफिल के अलावा अन्य कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है । यहां हम एक तकनीक है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करने के लिए जीना NETosing न्यूट्रोफिल के व्यवहार की जांच का वर्णन । हम यह भी विस्तार से एक बार संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग कर डबल immunolabeling रूपसे यों तो जाल और उनके घटकों जैसे MPO और कुत्ते न्यूट्रोफिल10में citH3 के रूप में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल नाभिक अनुरूपता में परिवर्तन और cfDNA रिहाई में बदलाव का पालन करने के लिए एक सेल permeant डाई और एक सेल impermeant डाई का उपयोग कर न्यूट्रोफिल कुत्ते रहते हैं । इस परख का मुख्य लाभ यह है कि यह व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इसी लेखक मॉरिस एनिमल फाउंडेशन (D15CA-९०७) द्वारा वित्त पोषित किया गया । अध्ययन के कैलिफोर्निया, डेविस, घोड़े के स्वास्थ्य और साथी पशु स्वास्थ्य के लिए केंद्र (2016-24-एफ) के लिए केंद्र के विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक के आंकड़े और वीडियो के साथ उसकी सहायता के लिए ंघी गुयेन के साथ उसकी सहायता के लिए गीना एनजी स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
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