In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi
Summary
Vi beskriva metoder för att isolera Hundarnas neutrofiler från helblod och visualisera NET bildandet i levande neutrofiler med fluorescensmikroskopi. Beskrev också är protokoll att kvantifiera NET bildandet och citrullinerade Histon H3 (citH3) uttryck med hjälp av immunofluorescens mikroskopi.
Abstract
Svar på invaderande patogener, frigör neutrofiler neutrofila extracellulära fällor (nät), dvs extracellulära nätverk av DNA som pryds av histoner och antimikrobiella proteiner. Överdriven NET bildandet (NETosis) och citH3 release under sepsis är associerad med flera organdysfunktion och dödlighet hos mus och människa men dess konsekvenser hos hundar är okänd. Häri, beskriver vi en teknik för att isolera Hundarnas neutrofiler från helblod för observation och kvantifiering av NETosis. Leukocyt-rich plasma, genereras av dextran sedimentering, avskiljs av kommersiellt tillgänglig täthet lutning separation media och granulocyter samlas in för cell count och genomförbarhet testning. För att observera realtid NETosis levande neutrofiler, läggs cell diffusionskoefficient och cell impermeant fluorescerande nukleinsyra fläckar till neutrofiler aktiveras antingen av lipopolysackarid (LPS) eller phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA). Förändringar i nukleära morfologi och NET bildandet observeras över tid av fluorescensmikroskopi. In vitro NETosis kännetecknas vidare av co-colocalization av cellfria DNA (cfDNA), myeloperoxidas (MPO) och citrullinerade Histon H3 (citH3) använder en modifierad dubbel-immunolabelling-protokoll. För att objektivt kvantifiera NET bildandet och citH3 uttryck med fluorescensmikroskopi, garn och citH3-positiva celler kvantifieras i en blindad sätt använder tillgänglig programvara. Denna teknik är en specifik analys att utvärdera in vitro- kapacitet Hundarnas neutrofiler att genomgå NETosis.
Introduction
Neutrofiler är kortlivade granulocyter ansvarar för det första försvaret mot invaderande patogener. Neutrofiler, rekryteras till platsen för infektion, eliminera mikroorganismer genom fagocytos, degranulering och generering av reaktivt syre arter (ROS)1. I närvaro av bakterier eller endotoxiner pryds neutrofiler release neutrofila extracellulära fällor (nät), sammansatt av extracellulära kromatin av histoner och granulat proteiner som elastase och myeloperoxidas (MPO)2. Även om nät har oumbärlig antimikrobiella egenskaper, antyder ökande experimentella och kliniska bevis att övernitisk NET bildandet sepsis kan leda till flera organ dysfunktion och död3,4, 5 , 6.
Eftersom nät kan spela en liknande patofysiologiska roll i hundar, kan terapeutiska interventioner att antingen förebygga eller minska NET bildandet tjäna som romanen behandlingsstrategier i septisk djur. Av denna anledning finns det ett behov av en pålitlig teknik för att bedöma och kvantifiera NETosis och NET komponenter hos hundar. NETTO komponenter inklusive cellfria DNA (cfDNA) och nucleosomes har tidigare utvärderats i Hundarnas neutrofiler och plasma från kliniska hundar7,8,9. Med hjälp av fluorescens analyser, funnit Goggs och Letendre att septisk hundar har högre cfDNA än friska hundar8. Även om dessa tekniker är mycket objektiv och kvantitativ, är mätning av cfDNA och nucleosomes som markörer för NETosis icke-specifik eftersom de kan härledas från nekrotiska celler än NETosing neutrofiler. Här beskriver vi en teknik som utnyttjar fluorescensmikroskopi för att undersöka beteenden av levande NETosing neutrofiler. Vi detalj också ett modifierat protokoll med dubbel-immunolabeling subjectively kvantifiera nät och deras komponenter såsom MPO och citH3 i Hundarnas neutrofiler10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar här ett protokoll för att observera förändringar i atomkärnor konformation och cfDNA release i levande hund neutrofiler med både en cell diffusionskoefficient färgämne och en cell impermeant dye. Den största fördelen med denna analys är att det tillåter realtid detektering av NET bildandet av högupplösande mikroskopi i levande neutrofiler utan cell fixering, därför ger en enkel och värdefullt verktyg för observation av in vitro- NET bildandet. Eftersom denna analys inte kräver a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Motsvarande författaren finansierades av stiftelsen Morris djur (D15CA-907). Studien har finansierats genom medel från University of California, Davis, Center för Equine hälsa och centrum för Companion Animal Health (2016-24-F). Författarna vill erkänna Geena Ng för hennes hjälp med siffror och Nghi Nguyen för hennes hjälp med video.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
