Syntese, karakterisering og anvendelse af superparamagnetiske jernoxid nanosonder til ekstrapulmonal tuberkulosedetektion
Summary
For at forbedre serologiske diagnostiske test for Mycobacterium tuberkulose antigener, vi udviklet superparamagnetiske jernoxid nanosonder til at opdage ekstrapulmonal tuberkulose.
Abstract
En molekylær billeddannelsesonde bestående af superparamagnetiskjernoxid (SPIO) nanopartikler og Mycobacterium tuberculosis overfladeantistof (MtbsAb) blev syntetiseret for at forbedre billeddannelsefølsomheden for ekstrapulmonal tuberkulose (ETB). En SPIO nanosonde blev syntetiseret og konjugeret med MtbsAb. Den rensede SPIO-MtbsAb nanosonde var karakteriseret ved hjælp af TEM og NMR. For at bestemme sondens målretningsevne blev SPIO-MtbsAb nanosonder inkuberet med Mtb til in vitroimaging analyser og injiceret i Mtb-inokulerede mus til in vivo-undersøgelse med magnetisk resonans (MR). Kontrastforbedringsreduktionen på magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) af Mtb- og THP1-celler viste proportional med SPIO-MtbsAb nanosondekoncentrationen. Efter 30 min intravenøs SPIO-MtbsAb nanosonde injektion i Mtb-inficerede mus, signalintensiteten af granulomatøse site blev forbedret med 14 gange i T2-vægtede MR-billeder sammenlignet med at modtage mus PBS injektion. MtbsAb nanosonderne kan bruges som en ny modalitet for ETB-detektion.
Introduction
På verdensplan udgør ekstraulattuberkulose (ETB) en betydelig andel af tuberkulosetilfælde. Ikke desto mindre, ETB diagnose er ofte savnet eller forsinket på grund af sin snigende kliniske præsentation og dårlige resultater på diagnostiske tests; falske resultater omfatter spytudstrygninger negative for syre-hurtig bacilli, mangel på granulomatous væv på histopatologi, eller manglende kultur Mycobacterium tuberkulose (Mtb). I forhold til typiske tilfælde forekommer ETB mindre hyppigt og indebærer ringe befrielse af Mtb bacilli. Desuden er det normalt lokaliseret på vanskelige at få adgang til websteder, såsom lymfeknuder, lungehinde, og osteoartikulære områder1. Invasive procedurer for opnåelse af passende kliniske prøver, hvilket gør bakteriologisk bekræftelse risikabel og vanskelig, er således væsentlige2,3,4.
Kommercielt tilgængelige antistofdetektionstest for ETB er upålidelige til klinisk påvisning på grund af deres brede følsomhed (0,00-1,00) og specificitet (0,59-1,00) for alle ekstrapulmonale steder tilsammen5. Enzym-linked immunospot (ELISPOT) analyser for interferon-γ, kultur filtrate protein (CFP), og tidlig sekretorisk egenogen mål (ESAT) er blevet brugt til diagnosticering latent og aktiv TB. Resultaterne varierer dog mellem forskellige sygdomssteder for diagnosticering af ETB6,7,8. Desuden gav ppd (renset proteinderivat) og QuantiFERON-TB ofte falske negative resultater9. QuantiFERON-TB-2G er en fuldblodsanalyse af blodimmunreaktivitet, som ikke kræver en prøve fra det berørte organ, og dette kan være et alternativt diagnostisk værktøj6,10,11. Andre diagnostiske metoder, der typisk anvendes til TB meningitis, såsom polymerase kædereaktion, er stadig for ufølsom til trygt udelukke klinisk diagnose12,13. Disse konventionelle tests viser utilstrækkelige diagnostiske oplysninger til at opdage den ekstrapulmonale infektion site. Der kræves således klinisk nye diagnostiske metoder.
Molekylær billeddannelse har til formål at designe nye værktøjer, der direkte kan screene specifikke molekylære mål for sygdomsprocesser in vivo14,15. Superparamagnetisk jernoxid (SPIO), et T2-vægtet NMR kontrastmiddel, kan i væsentlig grad øge specificiteten og følsomheden af magnetisk resonans (MR) imaging (MR)16,17. Denne nye funktionelle billeddannelse modalitet kan præcist skitsere væv ændringer på molekylært niveau gennem ligand-receptor interaktioner. I denne undersøgelse blev en ny molekylær billeddannelsessonde bestående af SPIO nanopartikler syntetiseret til konjugat med Mtb overfladeantistof (MtbsAb) til ETB-diagnose. SPIO nanosonder er minimalt invasive over for væv og organer, der undersøges18,19. Desuden kan disse nanosonder demonstrere præcise MR-billeder ved lave koncentrationer på grund af deres paramagnetiske egenskaber. Desuden synes SPIO nanosonder fremkalde mindst allergiske reaktioner, fordi tilstedeværelsen af jernioner er en del af normal fysiologi. Her blev følsomheden og specificiteten af DE SPIO-MtbsAb nanosonder, der er rettet mod ETB, evalueret i både celle- og dyremodeller. Resultaterne viste, at nanosonderne var gældende som ultrafølsomme billeddannelsesmidler til ETB-diagnose.
Protocol
Representative Results
Discussion
I lighed med relevante undersøgelser viste vores resultater vedrørende SPIO-MtbsAb nanosonder en betydelig specificitet for Mtb27,28. Den subkutane Mtb granulom blev fundet 1 måned efter TB injektion i musemodeller. Den typiske TB granulomatøse histologi resultater omfattede lymfocyt infiltration, tilstedeværelse af epiteliier makrofager, og neovaskularisering. Syre-hurtig bacilli blev spredt i TB læsioner, bekræfter MtbsAb immunhistokemi resultater. Dette…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for den finansielle støtte fra Økonomiministeriet Taiwan (tilskud NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) til at udføre dette forskningsarbejde. Dette manuskript blev redigeret af Wallace Academic Editing.
Materials
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
References
- Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
- Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, 25-55 (1984).
- Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
- Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
- Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
- Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
- Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
- Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
- Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
- Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
- Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
- Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).
- Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
- Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
- Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
- Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
- Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
- Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
- Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
- Woods, A. E., Ellis, R. . Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).
- Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
- Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
- Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
- Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
- von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).
