Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare
Summary
Per migliorare i test diagnostici sierologici per gli antigeni della tubercolosi Mycobacterium, abbiamo sviluppato nanosondie di ossido di ferro superparamagnetico per rilevare la tubercolosi extrapolmonare.
Abstract
Una sonda di imaging molecolare composta da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO) e anticorpo superficiale Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) è stata sintetizzata per migliorare la sensibilità all’imaging per la tubercolosi extrapolmonare (ETB). Un nanosonda SPIO è stato sintetizzato e coniugato con MtbsAb. La nanosonda SPIO-MtbsAb purificata è stata caratterizzata utilizzando TEM e NMR. Per determinare la capacità di targeting della sonda, le nanosonda SPIO-MtbsAb sono state incubate con Mtb per analisi di imaging in vitro e iniettate nei topi inoculati da Mtb per l’indagine in vivo con risonanza magnetica (MR). La riduzione del miglioramento del contrasto sulla risonanza magnetica (MRI) delle cellule Mtb e THP1 ha mostrato proporzionale alla concentrazione di nanosonda SPIO-MtbsAb. Dopo 30 minuti di iniezione di nanosonda SPIO-MtbsAb per via endovenosa in topi infettati da Mtb, l’intensità del segnale del sito di granulomatous è stata migliorata di 14 volte nelle immagini MR ponderate T2 rispetto a quella dei topi che ricevono l’iniezione PBS. Le nanosonda MtbsAb possono essere utilizzate come nuova modalità per il rilevamento ETB.
Introduction
A livello globale, la tubercolosi extrapolmonare (ETB) rappresenta una percentuale significativa di casi di tubercolosi (TB). Tuttavia, la diagnosi di ETB è spesso mancata o ritardata a causa della sua presentazione clinica insidiosa e delle scarse prestazioni sui test diagnostici; I falsi risultati includono squali esatti negativi per bacilli acido-veloce, mancanza di tessuto granulomatoso sulla istopatologia, o fallimento della cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Rispetto ai casi tipici, ETB si verifica meno frequentemente e comporta poca liberazione del Bacilli Mtb. Inoltre, di solito è localizzato in siti di difficile accesso, come linfonodi, pleura e aree osteoarticolari1. Pertanto, le procedure invasive per l’ottenimento di adeguati campioni clinici, che rendono la conferma batteriologica rischiosa e difficile, sono essenziali2,3,4.
I test di rilevamento degli anticorpi disponibili in commercio per l’ETB sono inaffidabili per il rilevamento clinico a causa della loro vasta gamma di sensibilità (0,00-1,00) e della specificità (0,59-1,00) per tutti i siti extrapolmonari combinati5. I saggi dell’immunospot indicizzato all’enzima (ELISPOT) per l’interferone-z, la proteina filtrante della coltura (CFP) e il bersaglio antigenico venoso precoce (ESAT) sono stati utilizzati per diagnosticare la tubercolosi e latb attiva. Tuttavia, i risultati variano tra diversi siti di malattia per la diagnosi di ETB6,7,8. Inoltre, la PPD cutanea (derivata della proteina purificata) e QuantiFERON-TB hanno spesso fornito risultati falsi negativi9. QuantiFERON-TB-2G è un saggio di reattività immunitaria del sangue intero, che non richiede un campione dall’organo interessato e questo può essere uno strumento diagnostico alternativo6,10,11. Altri metodi diagnostici tipicamente utilizzati per la meningite da TB, come la reazione a catena della polimerasi, sono ancora troppo insensibili per escludere con fiducia la diagnosi clinica12,13. Questi test convenzionali dimostrano informazioni diagnostiche insufficienti per scoprire il sito di infezione extrapolmonare. Pertanto, sono richieste clinicamente nuove modalità diagnostiche.
L’imaging molecolare mira a progettare nuovi strumenti in grado di vagliare direttamente specifici obiettivi molecolari dei processi di malattia in vivo14,15. L’ossido di ferro superparamagnetico (SPIO), un agente di contrasto NMR ponderato T2, può migliorare significativamente la specificità e la sensibilità dell’imaging a risonanza magnetica (MR) (MRI)16,17. Questa nuova modalità di imaging funzionale può disegnare con precisione i cambiamenti dei tessuti a livello molecolare attraverso interazioni ligando-recettore. In questo studio, è stata sintetizzata una nuova sonda di imaging molecolare, che comprende nanoparticelle SPIO, per coniugare con l’anticorpo superficiale Mtb (MtbsAb) per la diagnosi di ETB. Le nanosondpio SPIO sono minimamente invasive per tessuti e corpi in esame18,19. Inoltre, queste nanosonde possono dimostrare immagini REM precise a basse concentrazioni a causa delle loro proprietà paramagnetiche. Inoltre, le nanosonda SPIO appaiono suscitare reazioni meno allergiche perché la presenza di ioni di ferro fa parte della fisiologia normale. In questo caso, la sensibilità e la specificità delle nanosonde SPIO-MtbsAb rivolte a ETB sono state valutate sia nei modelli cellulari che in quelli animali. I risultati hanno dimostrato che le nanosonda erano applicabili come agenti di imaging ultrasensibili per la diagnosi di ETB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analogamente agli studi pertinenti, i nostri risultati relativi alle nanosinde SPIO-MtbsAb hanno dimostrato una specificità significativa per Mtb27,28. Il granuloma sottocutaneo Mtb è stato trovato 1 mese dopo l’iniezione di TB nei modelli murini. Le tipiche scoperte dell’istoologia granulomatosa della TB includevano l’infiltrazione dei linfociti, la presenza di macrofagi epiteliaidi e la neovascolarizzazione. I bacilli acido-veloci sono stati sparsi nelle lesi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario da parte del Ministero dell’Economia Taiwan (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) per eseguire questo lavoro di ricerca. Questo manoscritto è stato curato da Wallace Academic Editing.
Materials
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
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