Síntesis, caracterización y aplicación de nanosondas de óxido de hierro superparamagnético sin empleo para la detección de tuberculosis extrapulmonar
Summary
Para mejorar las pruebas diagnósticas serológicas de antígenos de Mycobacterium tuberculosis, desarrollamos nanosondas de óxido de hierro superparamagnético para detectar la tuberculosis extrapulmonar.
Abstract
Se sintetizó una sonda de imagen molecular compuesta por nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) y anticuerpos superficiales de Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) para mejorar la sensibilidad a la toma de imágenes para la tuberculosis extrapulmonar (ETB). Una nanosonda SPIO fue sintetizada y conjugada con MtbsAb. La nanosonda sPIO-MtbsAb purificada se caracterizó utilizando TEM y NMR. Para determinar la capacidad de focalización de la sonda, las nanosondas SPIO-MtbsAb se incubaron con Mtb para ensayos de imágenes in vitro y se inyectaron en ratones inoculados por Mtb para la investigación in vivo con resonancia magnética (RM). La reducción de la mejora del contraste en la resonancia magnética (RM) de las células Mtb y THP1 mostró proporcional a la concentración de nanosondas SPIO-MtbsAb. Después de 30 minutos de inyección intravenosa de nanosondas SPIO-MtbsAb en ratones infectados por Mtb, la intensidad de la señal del sitio granulomatoso se mejoró por 14 veces en las imágenes de RM ponderadas por T2 en comparación con la de los ratones que recibieron inyección de PBS. Las nanosondas MtbsAb se pueden utilizar como una modalidad novedosa para la detección de ETB.
Introduction
A nivel mundial, la tuberculosis extrapulmonar representa una proporción significativa de los casos de tuberculosis (TB). Sin embargo, el diagnóstico de ETB a menudo se olvida o se retrasa debido a su insidiosa presentación clínica y el bajo rendimiento en las pruebas diagnósticas; los resultados falsos incluyen frotis de esputo negativos para bacilos ácidos rápidos, falta de tejido granulomatoso en histopatología o falta de cultivo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). En relación con los casos típicos, la ETB ocurre con menos frecuencia e implica poca liberación de los bacilos de Mtb. Además, generalmente se localiza en sitios de difícil acceso, como ganglios linfáticos, pleura y áreas osteoarticulares1. Así, los procedimientos invasivos para la obtención de muestras clínicas adecuadas, lo que hace que la confirmación bacteriológica sea arriesgante y difícil, son esenciales2,3,4.
Las pruebas de detección de anticuerpos disponibles comercialmente para la ETB no son fiables para la detección clínica debido a su amplia gama de sensibilidad (0,00-1,00) y especificidad (0,59-1,00) para todos los sitios extrapulmonares combinados5. Los ensayos de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT) para el interferón, la proteína filtrada de cultivo (CFP) y el objetivo antigénico del secretor temprano (ESAT) se han utilizado para diagnosticar la tuberculosis latente y activa. Sin embargo, los resultados varían entre diferentes sitios de la enfermedad para el diagnóstico de ETB6,7,8. Además, la piel PPD (derivado de proteína purificada) y QuantiFERON-TB con frecuencia proporcionaron resultados falsos negativos9. QuantiFERON-TB-2G es un ensayo de reactividad inmune de sangre completa, que no requiere una muestra del órgano afectado y puede ser una herramienta de diagnóstico alternativa6,10,11. Otros métodos de diagnóstico utilizados normalmente para la meningitis por tuberculosis, como la reacción en cadena de la polimerasa, siguen siendo demasiado insensibles a excluir con confianza el diagnóstico clínico12,13. Estas pruebas convencionales demuestran información diagnóstica insuficiente para descubrir el sitio de infección extrapulmonar. Por lo tanto, se requieren clínicamente nuevas modalidades de diagnóstico.
La imagen molecular tiene como objetivo diseñar nuevas herramientas que puedan examinar directamente objetivos moleculares específicos de los procesos de la enfermedad in vivo14,15. El óxido de hierro superparamagnético (SPIO), un agente de contraste de RMN ponderado por T2, puede mejorar significativamente la especificidad y sensibilidad de la resonancia magnética (RM)16,17. Esta nueva modalidad de imagen funcional puede esbozar con precisión los cambios de tejido a nivel molecular a través de interacciones ligando-receptor. En este estudio, se sintetizó una nueva sonda de imágenes moleculares, que comprende nanopartículas SPIO, para conjugar con el anticuerpo de superficie Mtb (MtbsAb) para el diagnóstico de ETB. Las nanosondas SPIO son mínimamente invasivas para los tejidos y cuerpos bajo examen18,19. Además, estas nanosondas pueden demostrar imágenes mr precisas a bajas concentraciones debido a sus propiedades paramagnéticas. Además, las nanosondas SPIO aparecen que son menos alérgicas porque la presencia de iones de hierro es parte de la fisiología normal. Aquí, la sensibilidad y especificidad de las nanosondas SPIO-MtbsAb dirigidas a ETB se evaluaron tanto en modelos celulares como animales. Los resultados demostraron que las nano sondas eran aplicables como agentes de imágenes ultrasensibles para el diagnóstico de ETB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al igual que en estudios relevantes, nuestros hallazgos sobre nanosondas SPIO-MtbsAb demostraron una especificidad significativa para Mtb27,28. El granuloma subcutáneo de Mtb se encontró 1 mes después de la inyección de tuberculosis en los modelos de ratón. Los hallazgos típicos de la histología granulomatosa de tuberculosis incluyeron infiltración de linfocitos, presencia de macrófagos epitelioides y neovascularización. Los bacilos ácidos rápidos se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos por el apoyo financiero del Ministerio de Economía de Taiwán (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) para realizar este trabajo de investigación. Este manuscrito fue editado por Wallace Academic Editing.
Materials
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
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