Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar
Summary
Para melhorar os testes diagnósticos sorológicos para antígenos de tuberculose mycobacterium, desenvolvemos nanoprobes de óxido de ferro superparamagnético para detectar tuberculose extrapulmonar.
Abstract
Uma sonda de imagem molecular composta por nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) e anticorpo de superfície mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) foi sintetizada para aumentar a sensibilidade à imagem para tuberculose extrapulmonar (ETB). Uma nanosonda SPIO foi sintetizada e conjugada com MtbsAb. A nanoprobe SPIO-MtbsAb purificada foi caracterizada usando TEM e NMR. Para determinar a capacidade de direcionamento da sonda, as nanoprobes SPIO-MtbsAb foram incubadas com Mtb para ensaios de imagem in vitro e injetadas em camundongos inoculados em Mtb para investigação in vivo com ressonância magnética (MR). A redução do aumento do contraste na ressonância magnética (Ressonância Magnética) das células Mtb e THP1 mostrou-se proporcional à concentração de nanoprobe SPIO-MtbsAb. Após 30 min de injeção de nanosonda SPIO-MtbsAb intravenosa em camundongos infectados por Mtb, a intensidade do sinal do sítio granulomatoso foi reforçada por 14 vezes nas imagens de MR ponderadas t2 em comparação com a dos camundongos que recebem injeção de PBS. As nanoprobes MtbsAb podem ser usadas como uma nova modalidade para detecção de ETB.
Introduction
Globalmente, a tuberculose extrapulmonar (ETB) representa uma proporção significativa de casos de tuberculose (TB). No entanto, o diagnóstico de ETB é muitas vezes perdido ou atrasado devido à sua apresentação clínica insidiosa e ao baixo desempenho nos testes diagnósticos; resultados falsos incluem manchas de esputados negativos para bacilos rápidos ácidos, falta de tecido granulomatoso na histopatologia ou falha na cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Em relação aos casos típicos, o ETB ocorre com menos frequência e envolve pouca libertação do bacilo Mtb. Além disso, geralmente é localizado em locais de difícil acesso, como linfonodos, pleura e áreas osteoarticulares1. Assim, os procedimentos invasivos para a obtenção de amostras clínicas adequadas, o que torna a confirmação bacteriológica arriscada e difícil, são essenciais2,3,4.
Testes de detecção de anticorpos disponíveis comercialmente para ETB não são confiáveis para detecção clínica devido à sua ampla gama de sensibilidade (0,00-1,00) e especificidade (0,59-1,00) para todos os locais extrapulmonares combinados5. Ensaios imunospotas ligados à enzima (ELISPOT) para interferon-γ, proteína filtrante de cultura (PCP) e alvo antigênico secreto (ESAT) precoce têm sido usados para diagnosticar tb latente e ativa. No entanto, os resultados variam entre diferentes locais da doença para o diagnóstico de ETB6,7,8. Além disso, o PPD da pele (derivado de proteína purificada) e a QuantiFERON-TB frequentemente forneceram resultados negativos falsos9. QuantiFERON-TB-2G é um ensaio de reatividade imunoambiental sanguínea inteiro, que não requer umespécime do órgão afetado e esta pode ser uma ferramenta de diagnóstico alternativa6,10,11. Outros métodos diagnósticos tipicamente utilizados para meningite de TB, como a reação da cadeia de polimerase, ainda são muito insensíveis para excluir com confiança o diagnóstico clínico12,13. Estes testes convencionais demonstram informações diagnósticas insuficientes para descobrir o local da infecção extrapulmonar. Assim, novas modalidades diagnósticas são clinicamente exigidas.
A imagem molecular visa projetar novas ferramentas que possam rastrear diretamente alvos moleculares específicos de processos de doenças em14,15. Óxido de ferro superparamagnético (SPIO), um agente de contraste nmr ponderado t2, pode aumentar significativamente a especificidade e sensibilidade da imagem de ressonância magnética (MR) (MrI)16,17. Esta nova modalidade de imagem funcional pode esboçar precisamente as alterações teciduais no nível molecular através de interações ligand receptores. Neste estudo, uma nova sonda de imagem molecular, composta por nanopartículas SPIO, foi sintetizada para conjugar com anticorpo superficial Mtb (MtbsAb) para diagnóstico de ETB. As nanosondas spio são minimamente invasivas a tecidos e corpos exame18,19. Além disso, essas nanoprobes podem demonstrar imagens precisas de Mr em baixas concentrações devido às suas propriedades paramagnéticas. Além disso, as nanosondas SPIO parecem provocar reações menos alérgicas porque a presença de íons de ferro faz parte da fisiologia normal. Aqui, foram avaliadas a sensibilidade e especificidade das nanoprobes SPIO-MtbsAb voltadas para o ETB em modelos celulares e animais. Os desfechos demonstraram que as nanoprobes eram aplicáveis como agentes de imagem ultrasensíveis para o diagnóstico de ETB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Semelhante aos estudos relevantes, nossos achados sobre nanoprobes SPIO-MtbsAb demonstraram uma especificidade significativa para Mtb27,28. O subcutâneo Mtb granuloma foi encontrado 1 mês após injeção de TB nos modelos do mouse. Os achados típicos de histologia granulomatosa da TB incluíram infiltração linfócito, presença de macrófagos epitelióides e neovascularização. Bacilos rápidos de ácido foram espalhados nas lesões de TB, corroborando os a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos pelo apoio financeiro do Ministério da Economia taiwan (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) para realizar este trabalho de pesquisa. Este manuscrito foi editado pela Edição Acadêmica wallace.
Materials
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
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