Induction de Plaques d’athérome grâce à l’Activation des récepteurs minéralocorticoïdes chez les souris déficientes en apolipoprotéine E
Summary
Les auteurs décrivent un protocole visant à induire l’athérosclérose à la racine aortique de l’ApoE– / – souris nourries avec un régime athérogène, grâce à un rejet constant de l’aldostérone. Méthodes pour caractériser la composition de la plaque sont également décrites.
Abstract
L’athérosclérose est due à une réaction inflammatoire chronique affectant l’endothélium vasculaire et est favorisée par plusieurs facteurs tels que l’hypertension, la dyslipidémie et diabète. A ce jour, il y a preuve à l’appui d’un rôle pour l’aldostérone en circulation comme un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. Modèles de souris transgéniques ont été générés pour étudier les processus cellulaires et moléculaires, conduisant à l’athérosclérose. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole qui profite d’une perfusion continue de l’aldostérone dans ApoE– / – souris et génère des plaques d’athérome dans la racine aortique après 4 semaines de traitement. Nous avons, par conséquent, illustrent une méthode pour la quantification et la caractérisation des lésions athéroscléreuses au niveau de la racine aortique. La valeur ajoutée de la perfusion d’aldostérone est représentée par la génération des lésions athéroscléreuses riches en lipides et en cellules inflammatoires après 4 semaines de traitement. Nous décrivons en détail les méthodes de coloration afin de quantifier la teneur en lipides et macrophages au sein de la plaque. Notamment, dans ce protocole, nous réalisons le coeur tissu-incorporation en octobre afin de préserver l’antigénicité du tissu cardiaque et faciliter la détection des antigènes d’intérêt. Analyse du phénotype plaque représente une approche valide d’étudier la physiopathologie du développement de l’athérosclérose et d’identifier de nouvelles cibles pharmacologiques pour le développement de médicaments anti-athérogènes.
Introduction
L’athérosclérose est l’une des principales causes de mortalité et morbidité dans le monde1. Elle est caractérisée par un état inflammatoire chronique où les vaisseaux sanguins sont infiltrés par les lipides et les leucocytes qui déterminent la formation des plaques d’athérosclérose. La majorité des événements cardiaques aigus est associée à des événements thrombotiques en raison de la rupture de la plaque. Sujettes à la rupture des plaques sont définis « vulnérables » et sont caractérisées par l’infiltration accrue des leucocytes pro-inflammatoires, un noyau nécrotique et un couvercle fibreux fin2. Au cours des dernières décennies, les études cliniques et expérimentales ont clarifié la physiopathologie complexe de la maladie. Plusieurs modèles animaux sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de l’athérosclérose,3. La souris est actuellement les espèces les plus fréquemment utilisées pour étudier l’athérosclérose malgré quelques différences propres à chaque espèce existant dans sa physiopathologie en comparaison avec les humains. En particulier, cholestérol en circulation se compose principalement de lipoprotéines de haute densité (avec des propriétés antiathérogènes) dans des modèles murins, tandis que chez les humains en circulation cholestérol est principalement transporté comme les lipoprotéines de basse densité (LDL), probablement ce qui représente la principale raison pourquoi les souris de type sauvage ne développent pas d’athérosclérose spontanée4. En outre, souris de type sauvage sont généralement résistantes à l’absorption de cholestérol provenant de l’alimentation, alors que les humains absorbent environ 50 % de cholestérol alimentaire4. Pour surmonter ces limites, plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées ont été générés. L’apolipoprotéine E-deficient souris (ApoE−/−) et LDL récepteur – carence souris (LDLr−/−) sont largement utilisés. Un régime riche en graisses riche en cholestérol, ApoE−/− souris développent plaque plus rapidement par rapport aux souris−−/LDLr, et pour cette raison, l’utilisation desouris ApoE−/ est plus répandu que celui de LDLr−/−souris5,6. Les souris ApoE− −/développent des lésions à un stade quelconque de l’athérosclérose et sont comparables à celles observées chez les humains, bien que les plaques de souris ne montrent pas un phénotype instable7. En général, ApoE−/− souris développent spontanément l’athérosclérose et ce processus est accéléré par une alimentation occidentale3. La sévérité de l’athérosclérose peut être évaluée au niveau de la carotide, pneumologie, fémorale et artère brachiocéphalique et la racine aortique6. En particulier, la racine aortique représente un site anatomique enclin à développer des lésions athéroscléreuses chez la souris. Pour cette raison, il est pratique courante d’évaluer la formation de plaques d’athérome dans cette région.
Plusieurs études ont montré que l’aldostérone est impliquée dans le développement de l’athérosclérose8,9,10. Perfusion d’aldostérone dans ApoE−/− souris nourries avec un régime athérogène accélère le développement des lésions athéroscléreuses racine aortique induisant la formation de plaque enflammée et riches en lipides10.
En résumé, les auteurs décrivent un protocole dont la perfusion d’aldostérone, diète athérogène alimentation, incorporant des tissus cardiaques, quantification et caractérisation des lésions athéroscléreuses dans ApoE– / – souris. Cette procédure favorise une formation efficace des plaques d’athérome enflammées, riche en lipides et représente un modèle précieux pour l’étude de l’athérogenèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’athérosclérose est une affection inflammatoire chronique associée à grandes et moyennes des navires faisant intervenir des interactions entre plusieurs types de cellules, telles que les macrophages, lymphocytes T, les cellules endothéliales et les cellules de muscle lisse1. Malgré les limites des modèles murins d’athérogènes, un grand nombre de preuves sur le processus athérosclérotique est disponible. Ces modèles ont l’avantage de générer rapidement des cohortes expérimenta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le ministère italien de la santé (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 et PE-2011-02347070 à M.C.)
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
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