Induktion von atherosklerotischen Plaques durch Aktivierung von Mineralocorticoid-Rezeptoren im Apolipoprotein E-defizienten Mäusen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Atherosklerose in die Aortenwurzel von ApoE– / – Mäusen gefüttert mit einem atherogenen Diät durch eine kontinuierliche Freisetzung von Aldosteron zu induzieren. Methoden zur Charakterisierung von Plaque Zusammensetzung werden ebenfalls beschrieben.
Abstract
Atherosklerose ist aufgrund einer chronischen Entzündungsreaktion beeinflussen Gefäßendothels und wird durch verschiedene Faktoren wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen und Diabetes gefördert. Bisher gibt es Beweise für eine Rolle für zirkulierenden Aldosteron als Risikofaktor für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Krankheit zu unterstützen. Transgenen Mausmodellen wurden erstellt, um die zellulären und molekularen Prozesse, die zu Arteriosklerose führen zu studieren. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Protokoll, die nutzt die Vorteile der kontinuierlichen Infusion von Aldosteron bei ApoE– / – Mäusen und erzeugt arteriosklerotische Plaques in der Aortenwurzel nach 4 Wochen der Behandlung. Wir zeigen daher eine Methode zur Quantifizierung und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen auf der Ebene der Aortenwurzel. Der Mehrwert der Aldosteron-Infusion wird durch die Generation der reich an Lipiden und Entzündungszellen atherosklerotische Läsionen nach 4-wöchiger Behandlung dargestellt. Wir beschreiben ausführlich die befleckenden Verfahren zur Quantifizierung der Lipid- und Makrophagen Inhalt innerhalb der Plakette. Insbesondere in diesem Protokoll führen wir Herzen im OAT Nachweisbarkeit von Antigenen von Interesse zu bewahren die Antigenität von Herzgewebe Gewebe einbetten. Analyse der Plaque-Phänotyp ist einen gültigen Ansatz, die Pathophysiologie der Atherosklerose-Entwicklung zu studieren und um neue pharmakologische Targets für die Entwicklung von Anti-atherogenen Drogen zu identifizieren.
Introduction
Arteriosklerose ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit1. Es zeichnet sich durch eine chronische entzündliche Zustand, wo Blutgefäße infiltriert werden durch Lipide und Leukozyten, die die Bildung von atherosklerotischen Plaques zu bestimmen. Die Mehrheit der akuten kardialen Ereignissen sind verbunden mit thrombotischen Ereignissen durch Plaque-Ruptur. Plaques anfällig für Bruch “anfällig” definiert werden und zeichnen sich durch erhöhte Infiltration von Pro-inflammatorischen Leukozyten, einem nekrotischen Kern und eine dünne fibröse Kappe2. In den letzten Jahrzehnten haben klinische und experimentelle Studien der komplexen Pathophysiologie der Erkrankung geklärt. Verschiedenen Tiermodellen werden verwendet, um die molekularen Mechanismen der Induktion von Atherosklerose3zu untersuchen. Die Maus ist derzeit die am häufigsten verwendeten Arten, Atherosklerose trotz einiger artspezifische Unterschiede in der Pathophysiologie im Vergleich zu Menschen zu studieren. Insbesondere zirkulierenden Cholesterin von High-Density-Lipoproteine (mit antiatherogenic Eigenschaften) in Mausmodellen besteht hauptsächlich während beim Menschen zirkulierenden Cholesterin vor allem als Low-Density-Lipoproteine (LDL) transportiert wird wahrscheinlich Vertretung der Hauptgrund, warum Wildtyp Mäusen nicht spontan Atherosklerose4entwickeln. Wildtyp-Mäusen sind darüber hinaus in der Regel resistent gegen die Aufnahme von Cholesterin aus der Nahrung, während Menschen rund 50 % des diätetischen Cholesterins4aufnehmen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere gentechnisch veränderte Mausmodelle generiert. Apolipoprotein E-defizienten Maus (ApoE−/−) und LDL-Rezeptor-defizienten Maus (LDLr−/−) sind weit verbreitet. Eine fettreiche cholesterinreichen Diät ApoE−/− Mäuse entwickeln Plaque mehr schnell im Vergleich zu LDLr−/−Mäuse, und aus diesem Grund ist die Verwendung von ApoE−/− Mäuse weiter verbreitet als die LDLr−/−Mäuse5,6. Die ApoE−/− Mäuse Läsionen in jedem Stadium der Arteriosklerose zu entwickeln und sind vergleichbar mit denen bei Menschen beobachtet, obwohl Maus Plaketten keine instabile Phänotyp7zeigen. In der Regel ApoE−/− Mäuse entwickeln spontan Atherosklerose und dieser Prozess wird beschleunigt, mit einem westlichen Diät3. Die Schwere der Atherosklerose kann auf der Ebene der Carotis, pulmonale, Femur- und Brachiocephalic Arterie und die Aortenwurzel6ausgewertet werden. Insbesondere stellt die Aortenwurzel einen anatomischen Ort anfällig für atherosklerotische Läsionen bei Mäusen zu entwickeln. Aus diesem Grund ist es üblich, die Bildung von atherosklerotischen Plaques in dieser Region zu bewerten.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass Aldosteron in der Entwicklung von Atherosklerose8,9,10beteiligt ist. Aldosteron-Infusion bei ApoE−/− Mäusen eine atherogenen Diät gefüttert beschleunigt die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen Aortenwurzel induzierende entzündet und lipidreichen Plaque-Bildung-10.
Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir ein Protokoll einschließlich Aldosteron Infusion, atherogenen Ernährung Fütterung, Einbettung von Herzen Gewebe, Quantifizierung und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen in ApoE– / – Mäusen. Dieses Verfahren fördert eine effiziente Bildung von entzündeten, lipidreichen arteriosklerotische Plaques und stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Atherogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arteriosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die große und mittlere Schiffe mit Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen, wie z. B. Makrophagen, T-Lymphozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zellen1zugeordnet. Trotz der Einschränkungen der murinen atherogenen Modelle gibt es ein großen Körper des Beweises auf den atherosklerotischen Prozess. Diese Modelle haben den Vorteil, schnell generieren experimentelle Kohorten von einem bestimmten Alter und Geschlecht. Mäuse z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem italienischen Gesundheitsministerium (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 und PE-2011-02347070, M.C)
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
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