Induzione delle placche aterosclerotiche attraverso l'attivazione dei recettori mineralcorticoidi nei topi E-carenti dell'apolipoproteina
Summary
Descriviamo un protocollo per indurre aterosclerosi nella radice aortica di ApoE– / – topi alimentati con una dieta atherogenic, attraverso un continuo rilascio di aldosterone. Inoltre vengono descritti metodi per caratterizzare la composizione della placca.
Abstract
Aterosclerosi è a causa di una risposta infiammatoria cronica che colpisce endotelio vascolare ed è promosso da diversi fattori quali ipertensione, dislipidemia e diabete. Ad oggi, ci è prova per sostenere un ruolo per la circolazione dell’aldosterone come fattore di rischio per lo sviluppo della malattia cardiovascolare. Modelli murini transgenici sono stati generati per lo studio dei processi cellulari e molecolari che conducono all’aterosclerosi. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo che si avvale dell’infusione continua dell’aldosterone nei topi di ApoE– / – e genera le placche aterosclerotiche in radice aortica dopo 4 settimane di trattamento. Abbiamo, quindi, illustrare un metodo per la quantificazione e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche a livello della radice aortica. Il valore aggiunto dell’infusione dell’aldosterone è rappresentato dalla generazione delle lesioni aterosclerotiche ricche di lipidi e cellule infiammatorie dopo 4 settimane di trattamento. Descriviamo in dettaglio le procedure di colorazione per quantificare il contenuto lipidico e dei macrofagi all’interno della piastra. In particolare, nel presente protocollo, eseguiamo cuore inclusione di tessuti in OCT al fine di preservare l’antigenicità del tessuto cardiaco e facilitare l’individuabilità degli antigeni di interesse. Analisi del fenotipo placca rappresenta un valido approccio per studiare la fisiopatologia dello sviluppo di aterosclerosi e di identificare nuovi bersagli farmacologici per lo sviluppo di farmaci anti–atherogenic.
Introduction
L’aterosclerosi è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo1. È caratterizzata da uno stato infiammatorio cronico, dove i vasi sanguigni sono infiltrati da lipidi e leucociti che determinano la formazione di placche aterosclerotiche. La maggior parte degli eventi cardiaci acuti è associata con gli eventi trombotici a causa della rottura della placca. Placche alla rottura incline sono definite “vulnerabili” e sono caratterizzate da una maggiore infiltrazione dei leucociti pro-infiammatorie, un core necrotico e un cappuccio fibroso sottile2. Negli ultimi decenni, gli studi clinici e sperimentali hanno chiarito la complessa patofisiologia della malattia. Parecchi modelli animali sono utilizzati per indagare i meccanismi molecolari coinvolti nell’induzione dell’aterosclerosi3. Attualmente, il mouse è la specie maggiormente utilizzata per studiare l’aterosclerosi nonostante alcune differenze specie-specifiche esistenti in relativa patofisiologia rispetto agli esseri umani. In particolare, colesterolo di circolazione è principalmente composta da lipoproteine ad alta densità (con proprietà antiatherogenic) in modelli murini, mentre negli esseri umani circolazione colesterolo è trasportato principalmente come lipoproteine a bassa densità (LDL), probabilmente che rappresenta la ragione principale perché topi wild-type non sviluppare aterosclerosi spontanea4. Inoltre, topi wild type sono generalmente resistenti ad assorbire colesterolo dalla dieta, mentre gli esseri umani assorbono circa il 50% di colesterolo dietetico4. Per superare queste limitazioni, sono stati generati diversi modelli murini geneticamente modificati. Mouse di apolipoproteina E-carente (ApoE−/−) e mouse ricevitore-carenti di LDL (LDLr−/−) sono ampiamente usati. Una dieta ad alta percentuale di grassi colesterolo alto, ApoE−/− topi sviluppano la placca più rapidamente rispetto ai topi−−/LDLr, e per questo motivo, l’uso di topi− −/di ApoE è più esteso che quello del LDLr−/−topi5,6. I topi− −/di ApoE sviluppano lesioni in qualsiasi fase della aterosclerosi e sono comparabili a quelli osservati negli esseri umani, anche se le piastre del mouse non mostrano un fenotipo instabile7. In genere, ApoE−/− topi sviluppano spontaneamente l’aterosclerosi e questo processo è accelerato con una dieta occidentale3. La severità di aterosclerosi può essere valutata a livello della carotide, polmonare, femorale e dell’arteria brachiocefalica e la radice aortica6. In particolare, la radice aortica rappresenta un sito anatomico incline sviluppano lesioni aterosclerotiche nei topi. Per questo motivo, è pratica comune per valutare la formazione di placche aterosclerotiche in questa regione.
Diversi studi hanno dimostrato che l’aldosterone è implicato nello sviluppo di aterosclerosi8,9,10. Infusione di aldosterone in ApoE−/− topi alimentati una dieta atherogenic accelera lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche della radice aortica, inducendo la formazione di placca infiammata e ricca di lipidi10.
In breve, descriviamo un protocollo tra cui infusione dell’aldosterone, dieta atherogenic alimentazione, incorporamento di tessuti del cuore, quantificazione e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nei topi di ApoE– / . Questa procedura favorisce un’efficiente formazione di placche aterosclerotiche infiammate, ricca di lipidi e rappresenta un valido modello per lo studio di atherogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’aterosclerosi è un disordine infiammatorio cronico connesso con medie e grandi vasi che coinvolgono interazioni tra diversi tipi di cellule, come i macrofagi, linfociti T, cellule endoteliali e cellule di muscolo liscio1. Nonostante le limitazioni dei modelli murini atherogenic, un grande corpo di prova il processo aterosclerotico è disponibile. Questi modelli hanno il vantaggio di generare rapidamente sperimentale coorti di una determinata età e sesso. Anche i topi mostrano un background gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della salute italiano (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 e PE-2011-02347070 a C.U.)
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
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