Indução de ateroma através da ativação de receptores de mineralocorticoide em camundongos deficientes em Apolipoprotein E
Summary
Descreveremos um protocolo para induzir a aterosclerose na raiz da aorta de ApoE– / – ratos alimentados com uma dieta aterogênico, através de uma contínua liberação de aldosterona. Também são descritos métodos para caracterizar a composição da placa bacteriana.
Abstract
Aterosclerose é devido a uma resposta inflamatória crônica, afetando o endotélio vascular e é promovido por vários fatores, tais como hipertensão arterial, dislipidemia e diabetes. Até à data, não há evidência para apoiar um papel para circulantes de aldosterona como um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Modelos de rato transgénico foram gerados para estudar processos celulares e moleculares que conduzem à aterosclerose. Este manuscrito, descrevemos um protocolo que tira proveito da infusão contínua de aldosterona em ApoE– / – ratos e gera ateroma na raiz aórtica após 4 semanas de tratamento. Estamos, portanto, ilustrar um método para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas no nível da raiz da aorta. O valor acrescentado da infusão de aldosterona é representado pela geração de lesões ateroscleróticas ricas em lipídios e células inflamatórias após 4 semanas de tratamento. Descrevemos em detalhes os procedimentos de coloração para quantificar o conteúdo lipídico e macrófagos dentro da placa. Notavelmente, neste protocolo, realizamos coração tecido-incorporação na OCT para preservar a antigenicidade do tecido cardíaco e facilitar a detecção de antígenos de interesse. Análise do fenótipo placa representa uma abordagem válida para estudar a fisiopatologia do desenvolvimento de aterosclerose e identificar novos alvos farmacológicos para o desenvolvimento de drogas anti aterogênico.
Introduction
A aterosclerose é uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo1. É caracterizada por um estado inflamatório crônico, onde os vasos sanguíneos estão infiltrados por lipídios e leucócitos que determinam a formação de ateroma. A maioria dos eventos cardíacos agudos está associada com eventos trombóticos, devido à ruptura da placa. Propenso a ruptura de placas são definidas como “vulneráveis” e caracterizam-se pela maior infiltração de leucócitos pró-inflamatórios, um núcleo necrótico e um fino fibroso cap2. Nas últimas décadas, estudos clínicos e experimentais clarificaram a complexa fisiopatologia da doença. Vários modelos animais são usados para investigar os mecanismos moleculares envolvidos na indução de aterosclerose3. Atualmente, o rato é a espécie mais frequentemente usada para estudar a aterosclerose, apesar de algumas diferenças espécie-específicas existentes na sua fisiopatologia em comparação com os humanos. Em particular, circular o colesterol é principalmente composta por lipoproteínas de alta densidade (com propriedades antiatherogenic) em modelos do rato, enquanto nos seres humanos circular o colesterol é principalmente transportado como lipoproteínas de baixa densidade (LDL), provavelmente representando a principal razão por que os ratos do selvagem-tipo não desenvolvem aterosclerose espontânea4. Além disso, o tipo selvagem ratos são geralmente resistentes a absorção de colesterol da dieta, Considerando que os seres humanos absorvem cerca 50% de colesterol dietético4. Para superar essas limitações, foram gerados vários modelos do rato geneticamente modificado. Mouse de Apolipoprotein E – deficiente (ApoE−/−) e LDL receptor – deficiente mouse (LDLr−/−) são amplamente utilizados. Em uma dieta de alto teor de gordura colesterol alto, ApoE ratos− −/desenvolvem a placa mais rápida em comparação com ratos−−/LDLr, e por este motivo, o uso de ratos− −/ApoE é mais difundida do que a do LDLr−/−ratos5,6. Os ratos− −/ApoE desenvolvem lesões em qualquer fase da aterosclerose e são comparáveis aos observados em humanos, embora placas de rato não mostram um fenótipo instável7. Geralmente, ApoE−/− ratos espontaneamente desenvolvem aterosclerose e este processo é acelerado com uma dieta ocidental3. A severidade da aterosclerose pode ser avaliada ao nível da carótida, femoral, pulmonar e artéria Braquiocefálica e a raiz aórtica6. Em particular, a raiz aórtica representa um sítio anatômico propenso a desenvolver lesões ateroscleróticas nos ratos. Por esta razão, é prática comum para avaliar a formação de ateroma nesta região.
Vários estudos têm mostrado que aldosterona está implicada no desenvolvimento de aterosclerose8,9,10. Infusão de aldosterona em ApoE−/− ratos alimentados com uma dieta aterogênico acelera o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas raiz aórtica, induzindo a formação de placa inflamada e rica em lipídios10.
Em resumo, nós descrevemos um protocolo, incluindo a infusão de aldosterona, aterogênico dieta alimentar, a incorporação de tecidos do coração, quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas em ApoE– / – ratos. Este procedimento promove uma formação eficiente de ateroma inflamadas, rica em lipídios e representa um modelo valioso para o estudo da atherogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada com navios grandes e médios envolvendo interações entre vários tipos de células, como macrófagos, linfócitos T, células endoteliais e células de músculo liso1. Apesar das limitações dos modelos aterogênico murino, um vasto corpo de evidências sobre o processo aterosclerótico está disponível. Estes modelos têm a vantagem de gerar rapidamente coortes experimentais de uma idade específica e gênero. Ratos também mostram…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministério italiano da saúde (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 e PE-2011-02347070 de M.C.)
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
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