基于荧光素酶的大抑癌 (拉图) 生物传感器监测河马信号通路活动
Summary
在这里, 我们提出一个基于荧光素酶的生物传感器, 以量化的激酶活性的大抑癌 (拉图)-一个中心激酶在河马信号通路。该生物传感器在基础和平移研究中有不同的应用, 目的是在体外和体内对河马通路调节器进行调查。
Abstract
河马信号通路是器官大小的守恒调节器, 在发育和肿瘤生物学中具有重要作用。由于技术上的挑战, 很难评估这一信号通路的活动, 并在生物环境中加以解释。现有的关于大肿瘤抑制物 (拉图) 的文献依赖于定性和不易放大的方法进行筛查。最近, 我们已经开发了一种生物发光传感器来监测拉图的激酶活性–河马激酶级联的核心成分。在这里, 我们描述了如何使用这种拉图生物传感器 (拉图 BS) 来描述河马通路调节器的过程。首先, 我们提供了一个详细的协议, 以调查抗原蛋白候选者 (例如, VEGFR2) 对拉图活动的影响, 使用拉图 BS。然后, 我们展示了如何使用的拉图 BS 可用于小规模激酶抑制剂屏幕。这项协议可以进行放大, 以执行更大的屏幕, 这无疑将确定新的管理者的河马路径。
Introduction
河马信号通路首先被确定在果蝇作为一个新的调节细胞生长和动物大小1,2。自初步发现以来, 越来越多的证据令人信服地表明, 河马通路在发展中起着关键作用 (如早期胚胎发育、器官大小控制和三维 [3 D] 形态学), 肿瘤发生 (例如, 肿瘤的发育、转移、血管生成、免疫逃逸、基因组不稳定、应激反应和耐药性, 以及组织稳态 (例如, 损伤后的干细胞更新和分化及组织再生)3,4,5,6,7,8,9,10. 河马信号频繁地失调在各种各样的癌症 7,8,9,10,11,12。因此, 阐明河马通路在肿瘤生物学、治疗和再生医学中的作用已成为生物医学研究中最热的领域之一。
简而言之, 在河马通路中, 在上游调控器 (例如, 细胞接触, 营养压力和细胞外基质 [ECM]) 激活后, MST1/2 (MST;果蝇河马的哺乳动物同系物) 丝氨酸/苏氨酸 (s-/T) 激酶phosphorylate/激活适配器蛋白 hMOB1 和 WW45, 以及 LATS1/2 (拉图) 激酶, 随后, phosphorylate 转录的联合激活剂狂吠和它的 paralog 在保存的黄叶 (h/R/K) XX (S/T) (h, 组氨酸;R、精氨酸;K, 赖氨酸;S, 丝氨酸;T, 苏氨酸;X, 任何氨基酸) 的图案, 包括 YAP-S127 和 TAZ-S8911,12。S127-phosphorylated 狂吠 (YAP-pS127) 和 S89-phosphorylated (TAZ-pS89) 被泛或绑定到细胞质蛋白 14-3-3, 并防止与 TEAD1-4 转录因子在细胞核中的 transactivate 下游的互动细胞增殖和凋亡相关的基因 (图 1)。尽管对河马的路径有极大的兴趣, 但很少有测量河马信号的工具, 那些在历史上仅限于狂吠/TEAD 转录输出的记者。事实上, 直到最近, 没有任何工具, 以定量, 实时, 高通量, 和非侵入性的方式测量河马信号成分在体外和体内的动态和活动。
鉴于我们对蛋白质-蛋白质相互作用在生理学和病理学中的作用的认识日益加深, 人们非常感兴趣的是开发可用于定量和实时方式研究这些相互作用的工具13, 14,15,16。事实上, 生物分析战略的发展取得了重大进展, 其中包括酵母双杂交 (Y2H)17、表面等离子体共振 (SPR)18和 Förster 共振能量转移 (烦恼)19化验,来评估蛋白质与蛋白质的相互作用。然而, 这些方法的局限性是要求对记者的定位进行重要的优化, 这样就必须对许多构造进行测试以找到一个有效的。此外, 这些方法也有一个相对较低的信噪比, 这样辨别一个真正的正面信号可能是挑战。
为了克服这些局限性, 研制了蛋白质互补测定。第一代蛋白质互补检测是基于分裂多色荧光蛋白, 不能解决上述限制20。多色荧光蛋白仅由一个域组成, 使得很难将它们分成两个独立的稳定片段, 它们的亲和力和背景噪声为21。随后, 萤火虫荧光素酶被确定为一种新的候选体, 用于发展分裂蛋白互补测定。在这种方法中, 萤火虫荧光素酶被分成两个片段 (N 终端和 C 末端荧光素酶 [NLuc 和 CLuc]), 每个片段融合到目标蛋白的兴趣。如果 NLuc 和 CLuc 在两个靶蛋白的相互作用附近被带入接近度, 荧光素酶活性被重组, 并且在荧光素基底和 ATP22的存在下产生发光光。在 2001年, 通过使用一个包含 NLuc 和 CLuc 片段的库进行组合筛选, 在不同的地点切割并附着在斯坦福大学不同连接器、Paulmurugan 和 Gambhir 的蛋白质上, 开发出了一种优化的分裂萤火虫荧光素酶片段辅助互补系统用于蛋白质-蛋白质相互作用23。在这个系统中, 萤火虫荧光素酶被切割在氨基酸 (aa) 398 形成 NLuc 和 CLuc, 这是附加到两个感兴趣的蛋白质, 使用一个灵活的链接八甘氨酸残留和两个丝氨酸残留。
采用类似的方法, 我们最近开发了一种新的拉图-BS, 通过融合 NLuc 到 15 aa 在 S127 (YAP15) 的拉图磷酸化部位和 CLuc 与 14-3-3。没有使用全长的狂吠蛋白, 以避免其他上游监管机构对狂吠 (如其他部位的磷酸化和泛) 进行后转化后的混杂信号。在这里提出的拉图 BS 可以无创监测河马信号活动的活体细胞和体内的小鼠20,24 (图 2)。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以测量的拉图激酶活性的体外使用的拉图 BS。首先, 我们展示了如何使用拉图 BS 来研究抗原蛋白对拉图活性的影响。然后, 我们展示了如何使用生物传感器来监测河马通路的治疗后, 与调控河马路径的活动。该协议可用于识别和表征信号通路或刺激调节拉图激酶活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然河马通路在各种生物过程中起着关键作用, 失调的河马通路导致癌症6, 但如何根据各种刺激来调节河马通路是不完全理解的。此外, 还没有定量和实时系统来评估河马核心成分的活动。最近, 我们研制并验证了一种新的生物传感器, 用于测量河马通路24中的拉图激酶活性。这种生物传感器不仅可以定量和准确地监测活细胞中的河马信号活动, 而且还可用于针对?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了加拿大卫生研究所 ( CIHR # 119325 , 148629 ) 和加拿腺癌基金会 ( CBCF ) 提供给 XY 的赠款的支持。TA 得到加拿大 Vanier 研究生奖学金和安大略省国际研究生奖学金的支持。HJJVR 获得伊丽莎白二世科技研究生奖学金的支持。
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
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