Мониторинг Бегемот, сигнальный путь активности с помощью биосенсора супрессор (лат) на основе Люцифераза большой опухоли
Summary
Здесь мы представляем на основе Люцифераза биосенсора для количественного определения активности протеинкиназы большие опухолевые супрессоры (лат)-Центральный киназы в бегемота, сигнальный путь. Этот биодатчик имеет разнообразные применения в базовых и трансляционного исследования, направленные на расследование Бегемот путь регуляторы в пробирке и в естественных условиях.
Abstract
Бегемот, сигнальный путь является регулятором сохраняется размер органа и важную роль в биологии развития и рака. Из-за технических проблем по-прежнему трудно оценить деятельность этой сигнальный путь и интерпретировать его в биологическом контексте. В существующей литературе по большие опухолевые супрессоры (лат) опирается на методы, которые носят качественный характер и не может легко быть увеличен для скрининга. Недавно мы разработали на основе биолюминесценции биосенсора для мониторинга активности протеинкиназы ЛАТОВ а основного компонента Каскад киназы Бегемот. Здесь мы описываем процедуры как это биосенсор ЛАТОВ (ЛАТОВ-BS) может использоваться для характеристики Бегемот путь регуляторы. Во-первых мы предоставляем подробный протокол для расследования эффект гиперэкспрессия белка кандидата (например, VEGFR2) на активность ЛАТОВ, используя ЛАТОВ-BS. Затем мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для небольших киназы ингибитора экрана. Этот протокол реально может быть увеличен для выполнения больших экранов, которые несомненно будут определены новые регуляторы Бегемот пути.
Introduction
Бегемот, сигнальные пути была впервые выявлена у дрозофилы как Роман регулятор роста клеток и животных размер1,2. С момента ее первоначального открытия, монтаж доказательства убедительно показал, что бегемот путь играет важнейшую роль в развитии (например, раннего эмбрионального развития, орган управления размер и трехмерные [3-D] Морфология), опухолей () например, развитие опухоли, метастазы, ангиогенез, иммунных уклонение, геномной нестабильности, реакции на стресс и лекарственной устойчивости) и ткани гомеостаза (например, обновление стволовых клеток и дифференциации и регенерации тканей после травмы) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Бегемот сигнализации это часто dysregulated в различных раков7,8,9,10,,1112. Таким образом изучение функций Бегемот пути в биологии рака и терапии и регенеративной медицины стал одним из горячих районах в биомедицинских исследований.
В краткое, Бегемот пути, после активации регуляторами вверх по течению (например, контакт ячеек, биогенного стресса и внеклеточного матрикса [ECM]), киназы Серин/треонин (S/T) MST1/2 (MST; млекопитающих гомолог дрозофилы бегемота) фосфорилировать/активировать адаптер белки hMOB1 и WW45, а также киназы LATS1/2 (в ЛАТАХ), которые, впоследствии, фосфорилировать транскрипционный анализ совместного активатор YAP и его paralog таз на сохранение HX(H/R/K)XX(S/T) (H, гистидина; R, аргинин; K, лизин; S, серина; T, треонин; X, любой аминокислоты) мотивы, включая яп-S127 и таз-S8911,12. S127 фосфорилированных YAP (яп pS127) и S89-фосфорилированных таз (таз pS89) деградировавших в результате ubiquitination или привязку цитоплазматического белка 14-3-3 и лишены возможности взаимодействия с TEAD1-4 транскрипционные факторы в ядре для transactivate вниз по течению генов, участвующих в пролиферации и апоптоза (рис. 1). Несмотря на огромный интерес к Бегемот пути, существует несколько инструментов для измерения Бегемот сигналов и те, которые были исторически ограничивается журналистами транскрипционный анализ вывода YAP/таз/TEAD. Действительно, до недавнего времени, были не инструменты для измерения динамики и деятельности Бегемот сигнализации компоненты в количественных, реального времени, высокой пропускной способности и неинвазивным способом в пробирке и в естественных условиях.
Учитывая наши новые понимания роли белок белковых взаимодействий в физиологии и патологии, есть большой интерес к разработке инструментов, которые могут быть использованы для изучения этих взаимодействий в количественных и реального времени13, 14,,1516. Действительно достигнут значительный прогресс в развитии био аналитических стратегий, в том числе (Y2H) 2 гибрида дрождей17, поверхностного плазмон резонанс (СРП)18и Фёрстер резонанс энергии передачи (ЛАДА)19 анализов, для оценки взаимодействия протеин протеина. Однако эти подходы нести ограничение требует оптимизации репортер ориентации, таким образом, что многие конструкции должен быть испытан найти эффективный один. Кроме того эти подходы также имеют сравнительно низкое соотношение сигнал шум, таким образом, что взыскательных правда позитивных сигналов может быть сложным.
Белка дополнения анализов были разработаны, чтобы преодолеть эти ограничения. Первое поколение белка дополнения анализов был основан на Сплит многоцветной флуоресцирование белками и не может решить вышеупомянутые ограничения20. Многоцветная флуоресценции белков состоят из одного домена, что делает его трудно разделить их на две отдельные фрагменты стабильной с низкого сродства и фоновый шум21. Впоследствии Светлячок Люцифераза была определена как новый кандидат для использования при разработке Сплит белка дополнения анализов. В этом подходе Светлячок Люцифераза делится на два фрагмента (Люцифераза [NLuc и CLuc] N- и C-терминала) с каждого фрагмента, сливается с целевого белка интереса. Если NLuc и CLuc принесены в близости при взаимодействии двух целевых белков, воссоздана Люцифераза активность и биолюминесцентных свет генерируется при наличии люциферин субстрата и СПС22. В 2001 году выполняя комбинаторной скрининг с использованием библиотеки, содержащие NLuc и CLuc фрагменты разрезать на различных сайтах и придает белков с различными компоновщики, Paulmurugan и Гамбхир Стэнфордского университета разработали оптимизированные Сплит Светлячок Люцифераза фрагмент при содействии взаимодополняемости системы для взаимодействий протеин23. В этой системе Светлячок Люцифераза разрезается на аминокислоты (aa) 398 сформировать NLuc и CLuc, которые прикреплены к два протеинов интереса, с использованием гибких компоновщика восьми глицин остатков и остатков два серина.
Используя аналогичный подход, мы недавно разработали новый ЛАТОВ-BS путем сплавления NLuc до 15 АА штата Яп, окружающие место фосфорилирование ЛАТОВ на S127 (YAP15) и CLuc с 14-3-3. Полнометражный YAP белка не использовался, чтобы избежать смешанных сигналов, столб-поступательные изменения других вышестоящих регуляторами штата Яп (например, фосфорилирование на других сайтах и ubiquitination). ЛАТ-BS, представленные здесь неинвазивно может контролировать Бегемот сигнализации деятельности как в пробирке в живых клетках и в естественных условиях в мышей20,24 (рис. 2). Здесь мы описываем подробный протокол для измерения ЛАТОВ киназы активность в пробирке с помощью ЛАТОВ-BS. Во-первых мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для исследовать эффект гиперэкспрессия белка на активность ЛАТОВ. Затем мы покажем, как биосенсор может использоваться для мониторинга активности Бегемот путь после лечения с агентами, регулирующие Бегемот путь. Этот протокол может использоваться для выявления и характеристики сигнальных путей или стимулы, регулирующие деятельность киназы ЛАТОВ.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как Бегемот путь играет важную роль в различных биологических процессах, и регуляции Бегемот путь приводит к рака6, как Бегемот путь регулируется в ответ на различные стимулы полностью не поняты. Кроме того был не количественные, так и в реальном времени системы д…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от грантов от Канадского института медицинских исследований (КНИИЗ #119325, 148629) и Канадский Фонд рака молочной железы (CBCF) для XY. TA поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии и стипендии выпускников Международного Онтарио. HJJVR поддерживается королевы Елизаветы II выпускников стипендии в области науки и техники.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
