Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)

Summary

Hier presenteren we een luciferase gebaseerde biosensor om te kwantificeren van het kinaseactiviteit van grote tumor suppressor (LATS)-een centrale kinase in de Hippo signalering traject. Deze biosensor heeft diverse toepassingen bij fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het onderzoeken van Hippo traject regelgevers in vitro en in vivo.

Abstract

Het nijlpaard signalering traject is een geconserveerde regulator van orgel grootte en heeft een belangrijke rol in de ontwikkeling en kanker biologie. Als gevolg van technische uitdagingen blijft het moeilijk de activiteiten beoordelen van dit signalering traject en interpreteren in een biologische kader. De bestaande literatuur over grote tumor suppressor (LATS) is afhankelijk van de methoden die zijn kwalitatieve en kunnen niet gemakkelijk worden geschaald-up voor screening. Onlangs hebben we een bioluminescentie gebaseerde biosensor voor het controleren van het kinaseactiviteit van LATS-een kernonderdeel van de Hippo kinase cascade ontwikkeld. We beschrijven hier, procedures voor hoe deze LATS biosensor (LATS-BS) kan worden gebruikt voor het karakteriseren van Hippo traject regelgevers. Ten eerste bieden wij een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van het effect van een overexpressie eiwit kandidaat (bijvoorbeeldVEGFR2) op LATS activiteit met behulp van de LATS-BS. Vervolgens laten we zien hoe de LATS-BS kan worden gebruikt voor een kleinschalige kinase inhibitor van de omwenteling-scherm. Dit protocol kan redelijkerwijs worden geschaald uit te voeren van de grotere schermen, die ongetwijfeld roman regelgevers van de Hippo-pathway identificeren zal.

Introduction

Het nijlpaard signalering traject was voor het eerst geïdentificeerd in Drosophila als een nieuwe regulator van celgroei en dierlijke grootte^1,2. Sinds de eerste ontdekking, montage bewijs heeft overtuigend aangetoond dat de Hippo-traject speelt belangrijke rol in de ontwikkeling (b.v., vroege embryonale ontwikkeling, orgel grootte controle en driedimensionale [3D] morfologie), tumorigenesis () bijvoorbeeld, tumor ontwikkeling metastase, angiogenese, immuun belastingontduiking, instabiliteit van het genoom, stressrespons en resistentie), en de weefsel homeostase (b.v., stamcel vernieuwing en differentiatie en weefselregeneratie na blessure) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. hippo signalering is vaak dysregulated in verschillende kankers^{7,8,9,10,11,12}. Daarom, ophelderen van de functies van de Hippo pathway Kankerbiologie therapeutics en regeneratieve geneeskunde uitgegroeid tot een van de heetste gebieden in biomedisch onderzoek.

In korte, in het traject van Hippo, na activatie door de stroomopwaartse regelgevende instanties (bijvoorbeeld, cel-cel contact, nutriënten stress en extracellulaire matrix [ECM]), MST1/2 (MST; zoogdieren homologen van Drosophila Hippo) serine/threonine (S/T) kinases phosphorylate/activeren adaptor eiwitten hMOB1 en WW45, evenals LATS1/2 (LATS) kinases die vervolgens transcriptionele co activator YAP en haar paralog TAZ op geconserveerde HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidine phosphorylate; R, arginine; K, lysine; S, serine; T, threonine; X, alle aminozuren) motieven, met inbegrip van YAP-S127 en TAZ-S89^11,12. S127-phosphorylated YAP (YAP-pS127) en S89-phosphorylated TAZ (TAZ-pS89) zijn afgebroken door ubiquitination of binden aan cytoplasmatische eiwit 14-3-3 en verhinderd zijn interactie met TEAD1-4 transcriptiefactoren in de kern aan het transactivate stroomafwaarts genen die betrokken zijn in de celproliferatie en apoptosis (Figuur 1). Ondanks de enorme interesse in het traject van Hippo, bestaan enkele hulpprogramma’s voor het meten van Hippo signalering en die historisch gezien beperkt tot verslaggevers van YAP/TAZ/TEAD transcriptionele output geweest. Tot voor kort waren er inderdaad geen gereedschap voor het meten van de dynamiek en de activiteit van de Hippo signalering van componenten in een kwantitatieve, real-time, hoge-doorvoer en niet-invasieve wijze zowel in vitro als in vivo.

Gezien onze opkomende begrip van de rol van eiwit-eiwitinteractie in fysiologie en pathologie, is er grote belangstelling voor de ontwikkeling van instrumenten die kunnen worden gebruikt voor de studie van deze interacties in een kwantitatieve en real-time wijze^{13, 14},^,15,16. Inderdaad, er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de ontwikkeling van bio-analytische strategieën, met inbegrip van de gist twee-hybride (Y2H)¹⁷, de oppervlakte plasmon resonantie (SPR)¹⁸en Förster resonance energy transfer (FRET)¹⁹ testen, voor de evaluatie van eiwit-eiwitinteractie. Deze benaderingen voeren echter de beperking van vereisen aanzienlijke optimalisatie van de verslaggever oriëntatie, zodanig dat veel constructies moeten worden getest om te zoeken naar een efficiënte. Verder, deze benaderingen hebben ook een relatief lage signaal-ruisverhouding, zodanig dat comforthotel een echte positieve signalering kan lastig zijn.

Eiwit complementatie assays werden ontwikkeld om deze beperkingen te overwinnen. De eerste generatie van eiwit complementatie tests was gebaseerd op split multicolor fluorescentie eiwitten en de voornoemde beperkingen²⁰niet kon oplossen. Multicolor fluorescentie eiwitten bestaan uit slechts één domein, waardoor het moeilijk moeten worden opgesplitst in twee afzonderlijke stabiele fragmenten met lage affiniteit en achtergrond lawaai²¹. Vervolgens, werd firefly luciferase geïdentificeerd als een nieuwe kandidaat voor gebruik bij het ontwikkelen van split eiwit complementatie testen. In deze aanpak, is firefly luciferase opgesplitst in twee fragmenten (N-terminal en C-terminal luciferase [NLuc en CLuc]) met elk fragment gesmolten tot een doel proteïne van belang. Als de NLuc en de CLuc nabijheid op de interactie van de twee doel-eiwitten binnenkomen, luciferase activiteit is aangemaakt en bioluminescente licht wordt gegenereerd in het bijzijn van luciferine substraat en ATP²². In 2001, door het uitvoeren van een Combinatorische screening met behulp van een bibliotheek met NLuc en CLuc fragmenten bezuinigd op verschillende plaatsen en gekoppeld aan eiwitten met verschillende linkers, Paulmurugan en Gambhir aan de Stanford-universiteit ontwikkelde een geoptimaliseerde split-firefly Luciferase fragment-bijgewoonde complementatie systeem voor eiwit-eiwit interacties²³. In dit systeem, is de firefly luciferase gesneden op aminozuur (aa) 398 tot het vormen van NLuc en CLuc, die zijn gekoppeld aan twee proteïnen van belang met behulp van een flexibele linker van acht glycine residuen en twee serine residuen.

Het gebruik van een soortgelijke aanpak, we onlangs ontwikkeld een nieuwe LATS-BS door te smelten van NLuc tot en met 15 aa van YAP rondom de LATS fosforylatie website op S127 (YAP15) en CLuc met 14-3-3. De full-length YAP-eiwit werd niet gebruikt, om te voorkomen dat de verstorende signalen door posttranslationele modificaties van YAP (b.v., fosforylatie op andere sites en ubiquitination) door andere stroomopwaartse regelgevende instanties. De LATS-BS gepresenteerde Activiteitenweergave Hippo signalering van de activiteit niet-gebeurt zowel in vitro in levende cellen en in vivo in muizen^20,24 (Figuur 2). Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van LATS kinase activiteit in vitro met behulp van de LATS-BS. Ten eerste, laten we zien hoe de LATS-BS kan worden gebruikt voor het onderzoeken van het effect van een overexpressie eiwit op LATS activiteit. Vervolgens laten we zien hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het controleren van de activiteit van de Hippo-traject na behandeling met agenten regulering van de Hippo-pathway. Dit protocol kan worden gebruikt om te identificeren en te karakteriseren signalering trajecten of prikkels LATS kinaseactiviteit reguleren.

Protocol

1. onderzoek van een vermeende Regulator van Hippo signalering met behulp van de LATS-BS Beplating en transfectie van cellen Voorbereiding van celkweek 1 x PBS, DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine en 0,25% trypsine-EDTA tot 37 ° C in een waterbad gedurende ongeveer 30 minuten warm. Grondig schoon een bioveiligheid kast met 70% ethanol. Plaats weefselkweek gerechten, Pasteur pipetten, serologische pipetten en tips van de pipet in de weefse…

Representative Results

De LATS-BS was cotransfected met verschillende genen te evalueren van hun effect op de LATS activiteit (Figuur 3). In dit experiment, werd Renilla gebruikt als een interne controle. De voorbijgaande uitdrukking van YAP-5SA, een constitutief actieve vorm van YAP, oorzaken toenemende YAP transcriptionele doelstellingen en een verdere verhoging in LATS kinaseactiviteit via een gevestigde feedback traject25. MST, de upstream activ…

Discussion

Terwijl de Hippo traject belangrijke rol in verschillende biologische processen speelt, en de disregulatie van de Hippo pathway tot kanker^{6 leidt}, is hoe de Hippo-traject is geregeld in reactie op verschillende stimuli niet volledig begrepen. Bovendien is er geen kwantitatieve en real-time systeem te beoordelen van de activiteit van de kernonderdelen van de Hippo. Onlangs, we ontwikkeld en gevalideerd van een roman biosensor voor het meten van de LATS kinaseactiviteit in de Hippo traject<sup class…

Materials

Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer