Hippo, activité de voie à l’aide d’un biocapteur de suppresseur (LATS) axée sur la luciférase grande tumeur de signalisation de surveillance
Summary
Nous présentons ici un biocapteur axée sur la luciférase afin de quantifier l’activité kinasique de suppresseur de tumeur grande (LAT)-une centrale kinase dans l’hippopotame voie de signalisation. Ce biocapteur a diverses applications en recherche fondamentale et translationnelle vise à déterminer l’Hippo voie régulateurs in vitro et in vivo.
Abstract
L’hippopotame, voie de signalisation est un régulateur conservé de la taille de l’organe et a un rôle important dans la biologie du développement et cancer. En raison de difficultés techniques, il reste difficile d’évaluer l’activité de cette voie de signalisation et de l’interpréter dans un contexte biologique. La littérature existante sur le suppresseur de tumeur grande (LATS) repose sur des méthodes qualitatives et ne peuvent pas facilement être mise à l’échelle en place pour le dépistage. Récemment, nous avons développé un biocapteur axée sur la bioluminescence pour surveiller l’activité de la kinase de la composante de LATS-a base de la cascade de kinase de Hippo. Nous décrivons ici les procédures pour comment ce biocapteur LATS (LATS-BS) peut être utilisé pour caractériser les régulateurs voie Hippo. Tout d’abord, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier l’effet d’une protéine surexprimée candidate (par exemple, VEGFR2) sur l’activité LATS utilisant le LATS-BS. Ensuite, nous montrons comment le LATS-BS peut être utilisé pour un écran d’inhibiteur de la kinase à petite échelle. Ce protocole peut être facilement mis à l’échelle en place pour effectuer des écrans plus grands, sans aucun doute déceler les nouveaux régulateurs de la voie de l’hippopotame.
Introduction
L’hippopotame signalisation voie a été identifié chez la drosophile comme un nouveau régulateur de croissance cellulaire et animale taille1,2. Depuis sa découverte initiale, montage des éléments de preuve convaincante démontre que la voie Hippo joue un rôle crucial dans le développement (p. ex., développement embryonnaire précoce, contrôle orgue de la taille et la morphologie tridimensionnelle [3D]), () tumorigenèse par exemple, le développement de tumeurs, métastases, angiogenèse, évasion immunitaire, instabilité génomique, réponse au stress et la résistance aux médicaments) et l’homéostasie tissulaire(par exemple, la régénération des cellules souches et différenciation et régénération des tissus après une blessure) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. signalisation hippo est fréquemment dysrégulation dans divers cancers7,8,9,10,11,12. Par conséquent, élucider les fonctions de la voie Hippo en biologie du cancer et de thérapeutique et de la médecine régénérative est devenue une des zones plus chaudes en recherche biomédicale.
En bref, dans la voie de l’hippopotame, lors de l’activation par les régulateurs en amont (p. ex., contact cellule-cellule, stress nutritif et la matrice extracellulaire [mec]), MST1/2 (MST ; des homologues chez les mammifères de Drosophila Hippo) kinases de sérine/thréonine (S/T) phosphoryler/activer adaptateur protéines hMOB1 et WW45, ainsi que les kinases LATS1/2 (LATS) qui, par la suite, phosphorylent l’activateur de la transcription co YAP et son paralogue TAZ à conservé HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidine ; R, arginine ; K, lysine ; S, sérine ; T, thréonine ; X, des acides aminés) motifs, y compris YAP-S127 et TAZ-S8911,12. S127-phosphorylés YAP (YAP-pS127) et TAZ S89-phosphorylés (TAZ-pS89) sont dégradés par ubiquitination ou lient à la protéine cytoplasmique 14-3-3 et ne peuvent pas interagir avec les facteurs de transcription TEAD1-4 dans le noyau de transactiver en aval gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et l’apoptose (Figure 1). Malgré l’intérêt énorme dans la voie de l’hippopotame, peu d’outils pour mesurer les Hippo de signalisation existe et ceux qui ont été historiquement limité à des journalistes de sortie transcriptionnelle YAP/TAZ/marchés DEAM. En effet, jusqu’à une date très récente, il n’y a pas d’outils pour mesurer la dynamique et l’activité de l’hippopotame signalisation composants de manière quantitative, en temps réel, haut débit et non invasif in vitro et in vivo.
Compte tenu de notre compréhension du rôle des interactions protéine-protéine en physiologie et en pathologie émergente, il y a beaucoup d’intérêt dans le développement d’outils qui peuvent servir à étudier ces interactions dans une manière quantitative et en temps réel13, 14,15,16. En effet, il y a eu des progrès significatifs dans le développement de stratégies de bio-analytique, notamment la levure-hybride (Y2H)17, la surface plasmon resonance (SPR)18et Förster resonance energy transfert (FRET)19 essais, pour évaluer les interactions protéine-protéine. Cependant, ces approches portent la limitation des nécessitant une optimisation significative de l’orientation de la journaliste, tels que les nombreuses constructions seront essayées pour trouver un efficace. En outre, ces approches ont également un ratio signal-bruit relativement faible, telles que peut être difficile de discerner un vrai positif de signalisation.
Tests de complémentation protéique ont été développés afin de surmonter ces limitations. La première génération de tests de complémentation protéique reposait sur les protéines de fluorescence multicolore de split et ne résolut pas les limites susmentionnées20. Protéines de fluorescence multicolore se composent d’un seul domaine, rendant difficile de diviser en deux fragments stables distinctes avec faible affinité et de bruit de fond21. Par la suite, luciférase firefly a été identifié comme un nouveau candidat pour une utilisation dans le développement de tests de complémentation protéique split. Dans cette approche, la luciférase firefly est divisé en deux fragments (luciférase [NLuc et CLuc] N-terminal et C-terminal) avec chaque fragment fusionné à une protéine cible d’intérêt. Si le NLuc et le CLuc sont mises en proximité sur l’interaction des protéines deux cibles, activité de la luciférase est reconstituée et lumière bioluminescente est généré en présence du substrat de la luciférine et ATP22. En 2001, en effectuant une projection combinatoire à l’aide d’une bibliothèque contenant des fragments NLuc et CLuc coupe à divers endroits et attaché aux protéines avec différents linkers, Paulmurugan et Garcin à l’Université Stanford mis au point un split-firefly optimisée système assisté par fragment complémentation luciférase d’interactions protéine-protéine23. Dans ce système, luciférase firefly est coupé à l’acide aminé (aa) 398 pour former des NLuc et CLuc, qui sont attachés aux deux protéines d’intérêt en utilisant un linker flexible de huit résidus glycine et deux résidus sérine.
En utilisant une approche similaire, nous avons développé récemment un nouveau LATS-BS en fusionnant NLuc à 15 aa de YAP entourant le site de phosphorylation LATS à S127 (YAP15) et CLuc avec 14-3-3. La protéine pleine longueur de YAP n’était pas utilisée, pour éviter la confusion des signaux par des modifications post-traductionnelles de YAP (par exemple, la phosphorylation à d’autres sites et l’ubiquitination) par d’autres organismes de réglementation en amont. Le LATS-BS présenté ici peut surveiller non invasive Hippo activité de signalisation aussi bien in vitro dans les cellules vivantes et en vivo en souris20,24 (Figure 2). Nous décrivons ici un protocole détaillé pour mesurer les LATS kinase activité in vitro en utilisant le LATS-BS. Tout d’abord, nous montrons comment le LATS-BS peut être utilisé pour étudier l’effet d’une protéine surexprimée sur l’activité LATS. Ensuite, nous montrons comment le biocapteur peut être utilisé pour surveiller l’activité de la voie Hippo après traitement avec des agents de régulation de la voie de l’hippopotame. Ce protocole peut être utilisé pour identifier et caractériser la signalisation des voies ou des stimuli réglementant l’activité kinase LATS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que la voie Hippo joue un rôle important dans divers processus biologiques, et le dérèglement de la voie Hippo mène au cancer6, comment la voie Hippo est régulée en réponse à divers stimuli n’est pas complètement compris. En outre, il n’y a eu aucun système en temps réel et quantitative pour évaluer l’activité des éléments de base Hippo. Récemment, nous avons développé et validé un biocapteur roman pour mesurer l’activité kinase LATS dans la voie de Hippo<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC #119325, 148629) et la Fondation canadienne de Cancer du sein (FCCS) de XY. TA est pris en charge par la bourse d’études supérieures du Canada Vanier et les bourses d’études supérieures du International (Ontario). HJJVR est pris en charge par une reine Elizabeth II bourses d’études supérieures en sciences et en technologie.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
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