Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor
Summary
Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.
Abstract
O hipopótamo via de sinalização é um regulador conservado do tamanho do órgão e tem papéis importantes na biologia do desenvolvimento e câncer. Devido a desafios técnicos, continua a ser difícil avaliar a atividade desta via de sinalização e interpretá-lo dentro de um contexto biológico. A literatura existente sobre o supressor de tumor grande (LATS) se baseia em métodos qualitativos e não podem facilmente ser escalado-acima para a seleção. Recentemente, temos desenvolvido um biossensor baseado em bioluminescência para monitorar a atividade da quinase do LATS-a principal componente da cascata da quinase hipopótamo. Aqui, descrevemos procedimentos de como este biosensor LATS (LATS-BS) pode ser usado para caracterizar reguladores de caminho de hipopótamo. Primeiro, nós fornecemos um protocolo detalhado para investigar o efeito de um candidato de proteína Blumental (por exemplo, VEGFR2) na atividade LATS usando o LATS-BS. Em seguida, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para uma tela de inibidor de quinase em pequena escala. Este protocolo viável pode ser dimensionado-up para executar telas maiores, o que sem dúvida irão identificar novos reguladores da via de hipopótamo.
Introduction
O hipopótamo sinalização via foi identificada em Drosophila como um romance regulador do crescimento celular e animal tamanho1,2. Desde a sua descoberta inicial, evidências convincentemente demonstrou que que o percurso de hipopótamo tem um papel crítico no desenvolvimento (por exemplo, desenvolvimento embrionário precoce, controle de tamanho de órgão e tridimensional [3D] morfologia), (tumorigênese por exemplo, desenvolvimento de tumor, metástase, angiogênese, evasão imune, instabilidade genômica, resposta ao estresse e resistência às drogas) e a homeostase do tecido (por exemplo, renovação de células-tronco e diferenciação e regeneração de tecidos após lesão) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. a sinalização de hipopótamo é frequentemente prejudicado em vários cânceres7,8,9,10,11,12. Por conseguinte, elucidar as funções da via hipopótamo na biologia do câncer e terapêutica e medicina regenerativa tornou-se uma das áreas mais quentes na investigação biomédica.
Em breve, na via de hipopótamo, após a activação pelos reguladores montante (por exemplo, contato célula-célula, stress nutriente e matriz extracelular [ECM]), quinase serina/treonina (S/T) de MST1/2 (MST; mamíferos homologs da drosófila Hippo) fosforilar/ativar adaptador proteínas hMOB1 e WW45, bem como as cinases de LATS1/2 (LATS) que, posteriormente, fosforilar ativador transcricional de co YAP e sua paralog TAZ em HX(H/R/K)XX(S/T) conservada (H, histidina; R, arginina; K, lisina; S, serina; T, treonina; X, qualquer aminoácidos) motivos, incluindo YAP-S127 e TAZ-S8911,12. YAP S127-fosforilada (YAP-pS127) e TAZ S89-fosforilada (TAZ-pS89) são degradados por ubiquitination ou ligam a proteína citoplasmática 14-3-3 e são impedidos de interagindo com fatores de transcrição TEAD1-4 no núcleo para transativar a jusante genes envolvidos na proliferação celular e apoptose (Figura 1). Apesar do enorme interesse na via de hipopótamo, existem poucas ferramentas para medir a sinalização de hipopótamo e aqueles que têm sido historicamente limitada aos repórteres de saída transcriptional YAP/TAZ/TEAD. Com efeito, até muito recentemente, não havia sem ferramentas para medir a dinâmica e a atividade do hipopótamo sinalização componentes de forma quantitativa, em tempo real, alta produtividade e não-invasiva tanto in vitro e in vivo.
Dada nossa compreensão do papel das interações da proteína-proteína em fisiologia e patologia de emergentes, há grande interesse no desenvolvimento de ferramentas que pode ser usado para estudar essas interações em uma forma quantitativa e em tempo real13, 14,15,16. Na verdade, tem havido um progresso significativo no desenvolvimento de estratégias de bio-analítica, incluindo do dois-híbrido de levedura (Y2H)17, a superfície plasmon ressonância (SPR)18e ensaios de19 do (FRET) de transferência de energia de ressonância Förster, para avaliar as interações da proteína-proteína. No entanto, essas abordagens carregam a limitação de que exigem otimização significativa da orientação do repórter, tal que muitas construções devem ser testadas para encontrar um eficiente. Além disso, essas abordagens também tem uma relativamente baixa relação sinal-ruído, tal que discernir uma sinalização positiva verdade pode ser um desafio.
Ensaios de complementação da proteína foram desenvolvidos para superar essas limitações. A primeira geração dos ensaios de complementação da proteína foi baseada em proteínas de fluorescência multicolor de divisão e não podia resolver as limitações acima referidas20. Proteínas de fluorescência multicolor consistem em apenas um domínio, tornando-se difícil separá-los em dois fragmentos separados de estáveis com baixa afinidade e ruído de fundo21. Posteriormente, luciferase de vaga-lume foi identificado como um novo candidato para uso no desenvolvimento de ensaios de complementação do separação da proteína. Nesta abordagem, luciferase de vaga-lume é dividido em dois fragmentos (N-terminal e C-terminal do luciferase [NLuc e CLuc]) com cada fragmento fundida a uma proteína do alvo de interesse. Se o NLuc e CLuc são trazidos para a proximidade com a interação das proteínas dois alvo, atividade do luciferase é reconstituída e luz bioluminescente é gerado na presença de substrato luciferina e ATP22. Em 2001, através da realização de uma análise combinatória usando uma biblioteca que contém fragmentos de NLuc e CLuc cortada em vários sites e ligado a proteínas com diferentes linkers, Paulmurugan e Glauber na Universidade de Stanford desenvolveram um otimizado split-vagalume sistema de complementação assistida por fragmento do luciferase de interações proteína-proteína23. Neste sistema, luciferase de vaga-lume é cortada em aminoácidos (aa) 398 para formar NLuc e CLuc, que estão ligados a duas proteínas de interesse usando um vinculador flexível de oito resíduos de glicina e dois resíduos de serina.
Usando uma abordagem similar, desenvolvemos recentemente um novo LATS-BS fundindo NLuc para 15 aa de YAP em torno do site de fosforilação LATS em S127 (YAP15) e CLuc com 14-3-3. A proteína de YAP completo não foi usada, para evitar confundir sinais por modificações borne-translational de YAP (por exemplo, a fosforilação em outros sites e ubiquitination) por outros reguladores upstream. O LATS-BS aqui apresentados não invasiva pode monitorar hipopótamo sinalização atividade tanto in vitro em células vivas e em vivo em ratos20,24 (Figura 2). Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir LATS quinase atividade no vitro usando o LATS-BS. Primeiro, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para investigar o efeito de uma proteína Blumental na atividade LATS. Em seguida, mostramos como o biosensor pode ser usado para monitorar a atividade da via hipopótamo após tratamento com agentes regulando o percurso de hipopótamo. Este protocolo pode ser usado para identificar e caracterizar a sinalização de percursos ou estímulos que regulam a atividade da quinase LATS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto via o hipopótamo tem um papel crítico em diversos processos biológicos, e desregulação da via hipopótamo leva ao câncer6, como o caminho de hipopótamo é regulamentado em resposta a vários estímulos não é completamente compreendido. Além disso, não houve nenhum sistema em tempo real e quantitativo para avaliar a atividade dos componentes principais do hipopótamo. Recentemente, temos desenvolvido e validado um romance biosensor para medir a atividade da quinase LATS no hipop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto canadense de pesquisas saúde (CIHR #119325, 148629) e a Fundação Canadense de câncer da mama (CBCF) para XY. TA é suportado pela bolsa de pós-graduação de Canadá Vanier e a bolsa de pós-graduação de Internacional de Ontário. HJJVR é suportado por uma rainha Elizabeth II bolsa pós-graduação em ciência e tecnologia.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
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