Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.

Abstract

Rezidiv wurde lange von Onkologen untersucht, während die zugrunde liegenden Mechanismen unklar bleiben. Vor kurzem fanden wir und andere, dass ein Phänomen namens Apoptose Umkehr zu erhöhten Tumorigenität in verschiedenen Zellmodellen unter verschiedene Reize führt. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Verfolgung dieser Prozess in vitro und in vivo; ist aber noch die Isolierung der echten umgekehrte Zellen erreicht werden, welche Grenzen unser Verständnis über die Folgen der Apoptose Umkehr. Hier nutzen wir einen Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff Label Zellen mit aktivierte Caspasen nach Induktion der Apoptose. Zellen mit positiven Signalen werden weiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) zur Verwertung aussortiert. Morphologische Untersuchung unter konfokalen Mikroskopie hilft den apoptotischen stand vor FACS bestätigen. Eine Zunahme der Tumorigenität kann oft die Höhe des Anteils der Krebsstammzellen (CSC) zugeschrieben werden-wie Zellen. Auch wäre angesichts die Heterogenität der Brustkrebs, Identifizierung des Ursprungs dieser CSC-ähnliche Zellen entscheidend für die Behandlung von Krebs. So bereiten wir nicht Stamm Brustkrebszellen vor Apoptose auslösen, Caspase-aktivierten Zellen zu isolieren und die Apoptose Umkehrung Verfahren durchführen. Flow-Zytometrie-Analyse zeigt, dass die CSC-wie Brustzellen wieder erscheinen im Bereich “umgekehrte” darauf hinweist, dass die CSC-wie Brustzellen von Brustkrebszellen-Stamm während der Apoptose Umkehr gereist sind. Zusammenfassend lässt sich sagen enthält dieses Protokoll die Isolierung von apoptotischen Brustkrebszellen und Erkennung von Veränderungen in CSC Prozentsatz in umgekehrter Zellen durch Durchflusszytometrie.

Introduction

Krebs ist eine führende Ursache des Todes, verursacht schwere Last zu Ländern weltweit¹gewesen. Brustkrebs zählt bei weiblichen Patienten unter allen Arten von Krebs¹hoch, sowohl in Bezug auf die Inzidenz und Mortalität. Aufgrund der Heterogenität Krebs ist eine Kombination von Medikamenten in der Regel in der Chemotherapie verwendet, um Krebs Zelle Tod^2,3,4zu erreichen. Jedoch da gemeinsame Chemotherapeutika oft DNA-^{5,6 Ziel}, betroffen Synthese^7,8 und/oder Mikrotubuli Proteindynamik⁹, schnell wachsende Zellen sind am meisten während ruhende Zellen wie Krebs-Stammzellen (CSC) s sind in der Regel weniger betroffenen¹⁰. CSCs sind daher eher nach der Behandlung überleben, später führt zu Resistenzen und Krebs^{10,11 Rezidiv}. Daher, Beseitigung von CSCs ist ein wichtiges Thema für die Krebsbehandlung geworden und Studie über den Ursprung des CSCs ist notwendig.

Weitere Studien über das Phänomen der Apoptose Umkehrung wurden im letzten Jahrzehnt^{12,13,14,15,16,17,18} durchgeführt ^{, 19}. vor der Entstehung dieses Konzeptes, es hat weit angenommen worden, dass Zellen irreversibel nach der Aktivierung der Caspase Apoptose. Caspasen sind eine Familie von Protein-Enzyme, die wichtige Rolle in der Initiierung und Durchführung Stadien der Apoptose, einschließlich der Bildung von komplexen apoptotische und die Spaltung von nachgelagerten Substrate²⁰spielen. Aktivierung von Caspasen Henker wie Caspase 3 oder Caspase 7 galt als der “Point Of No Return” für Apoptose²¹. Allerdings beobachteten Forscher vor kurzem, dass Umkehr Apoptose sowohl in-vitro tritt- und in-vivo, , während die Zellen sich von Apoptose auch nach Caspase Aktivierung^{12,13,14 erholen können , 15 , 16 , 17 , 18 , 19}. Darüber hinaus aggressive Merkmale wie z. B. höhere Beständigkeit gegen die ursprünglichen Apoptose-Induktor und höheren Invasivität werden in der umgekehrten Krebs erkannt Zellen¹⁵. Daher wurde vorgeschlagen, dass der Anteil der CSC-ähnlichen Zellen in der umgekehrten Bevölkerung im Vergleich zu den unbehandelten Zellen schließlich einen Beitrag zu mehr bösartigen Funktionen nach Apoptose Umkehr¹⁸höher wäre.

Zuvor wurden viele Anstrengungen unternommen, die Apoptose Umkehr in-vitro- und noch wichtiger, in vivo zu verfolgen die sehr helfen bei der Bestätigung der Universalität von diesem Prozess^16,17,19. Allerdings fehlt eine systemische Studie über die Folgen der umgekehrte Zellen aufgrund der unbefriedigenden Isolation von Zellen, die wirklich Apoptose Umkehr unterzogen wurden. Es muss eine reine Apoptotic Zellen zu erwerben und für weitere Studien zu erholen. Also, wir verwenden den traditionell anerkannten Marker der Henker Caspase Aktivierung als Marker für den “Point Of No Return”-²¹ für die Apoptose und nutzen Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) um Caspase-aktivierten Zellen befleckt Diskriminierung mit Farbstoff Caspase-3/7-Grün-Erkennung. Der Farbstoff ist kovalent verbunden mit eine kurze Aminosäuresequenz, DEVD, die erkannt und durch aktive Caspasen 3/7 abgespalten werden können. Die Spaltung hilft den Farbstoff freigeben, die aus dem Zytosol in den Zellkern translozieren wird, wo es bindet an DNA und starke Fluoreszenz emittiert. Dieses Verfahren vermeidet die Verwendung einer Bulk-Zell-Population, in der einige Zellen keine Apoptose durchgemacht haben können.

CSCs oder Tumor-initiierenden Zellen wurden in vielen soliden Tumoren, die mit einer einzigen oder eine Kombination aus mehreren Oberflächen Marker(s) und sehr wenige Zahlen dieser Zellen sind ausreichend, um Form Tumoren immungeschwächte Mäuse^{22,23, 24,25,26,27}. Häufig wird eine Kombination von CD44 und CD24 Brust CSC Studien und CD44⁺/CD24^– Zellen wurden definiert als die Brust CSCs^{26,27,28,29 , 30}. vor kurzem haben wir eine Reihe von Experimenten bestätigen die vorgeschlagene Beziehung zwischen Apoptose Umkehr und CSCs zu demonstrieren, dass umgekehrte Brustkrebszellen erhöhte Tumor bilden Fähigkeit in vitro und in vivo mit gewonnen durchgeführt ein erhöhter Anteil an Zellen mit CSC Marker¹⁸. Obwohl wir nicht ausschließen konnte, dass Brust CSCs besser überleben und somit nach Apoptose Umkehr, wichtig ist, bereichert wenn wir nicht-Stamm Krebszellen und Thema isolieren entstehen ihnen zu Apoptose Umkehr, CSC in der ursprünglich nicht-stem Krebs-Zell-Population, darauf hindeutet, dass nicht-Stammzellen Krebs, wie Zellen auf die Erhöhung des Anteils von CSCs während der Apoptose Umkehr beitragen können.

Dieser Artikel soll den Übergang von Brustkrebszellen-Stamm zu CSC-wie Brustzellen nach Apoptose Umkehr zu zeigen und diesen Übergang durch Durchflusszytometrie zu erkennen. -Stamm-Brustkrebszellen bereiten wir zunächst durch die Isolierung von CD44^–/CD24⁺ Brustkrebs Krebszellen durch FACS. Dann ist Apoptose induziert und durch morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop bestätigt. Danach sind Apoptotic Zellen positiv gekennzeichnet durch Caspase 3/7 Grün Erkennung Farbstoff durch FACS isoliert und weiter in das Fehlen von Apoptose induzieren Apoptose Umkehr kultiviert. Die umgekehrten Zellen sind dann nach 7 Tagen Erholung für durchflusszytometrischen Analyse mit CSC-Markern gefärbt. Zellen mit CD44⁺/CD24^– Marker erscheinen wieder in der umgekehrten Bevölkerung darauf hindeutet, dass Übergang von nicht-Stamm Krebszellen zu CSC-wie Zellen in Apoptose Umkehrung aufgetreten ist.

Apoptose Umkehr wurde in mehreren Krebs beobachtet Zelllinien sowie normale Primärzellen mit verschiedenen apoptotischen Stimuli in vitro-^12,13behandelt. Dieser Prozess hat auch in Drosophila verfolgt worden Modell in-vivo^16,17,19. Viele Informationen über die zugrunde liegenden Mechanismus der Krebs-Rückfall in verschiedenen Krebs-Krankheit-Modelle und die Herkunft des CSCs erhalten Sie durch den Einsatz der Technik wie in diesem Manuskript beschrieben.

Protocol

1. Vorbereitung der Brust nicht-Stamm Krebszellen Kultur MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen in 10 mL Phenol Rotfrei-Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in einer 100 mm Schale ergänzt. Kultur T47D in 10 mL Phenol Rotfrei RPMI 1640 Medium ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, Hitze-inaktivierten 10 % FBS und 1 % V/V Penicillin-Streptomycin (PS) in einer 100 mm Schale. Zellkulturen bei 37 ° C in einem 5 % CO295 % Luft Zelle Kultu…

Representative Results

Um den Übergang von der Brust nicht-Krebszellen zu CSC-wie Brustzellen, eine erste Sortierung der CD44 Stiel zu beobachten–/CD24+ Brustkrebs-Zellen wurden benötigt. Seit die MCF-7-Zell-Linie, die etwa 0,15 % Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Bevölkerung (Abbildung 1), dieser Schritt unterstützt CSC Bereicherung während der Apoptose Umkehr auszuschließen. Im Gegenteil, gäbe es keine Zellen mit CSC-Marker in der ursprü…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine direkte und klare Weise zur Erkennung von den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen in Brust CSC-ähnliche Zellen infolge Apoptose Umkehr. Bestätigung der CSC Eigenschaften dieser umgekehrte Zellen könnte gefördert werden, mit der ichn Vitro Mammosphere Bildung Assay und in Vivo Xenograft-Transplantation in immungeschwächte Mäuse^{18,24,26 ,…}

Materials

MCF-7	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-22
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
T47D	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate	Invitrogen	A35109
bovine serum albumin	USB	9048-46-8
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye	Invitrogen	C10423
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Fc block	Miltenyi Biotec	130-059-901
fetal bovine serum	Invitrogen	16000044	heat-inactivated
HEPES	USB	16926
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
L-glutamine	Invitrogen	25030081
Mitotracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512
monoclonal antibodies against human CD24	BD Biosciences	555428	PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44	BD Biosciences	560531	PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	554648	Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	558304	Clone:27-35 RRID:AB_647257
phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	21600010
propidium iodide	Invitrogen	P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium	Invitrogen	11835055	phenol red-free
sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
staurosporine	Sigma-Aldrich	S4400
Equipment
100 mm culture dish	Greiner Bio-One	664160
12-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	150628
Cell Strainer 40-μm nylon mesh	BD Biosciences	08-771-1
FACSuite software bundle v1.0	BD Biosciences	651360
FACSVerse	BD Biosciences	651155
FluoView FV1000 confocal microscope	Olympus	IX81	60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b	Olympus	–
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes	BD Biosciences	352003
S3e sorter	Bio-Rad	1451006