Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.
La recurrencia del cáncer durante mucho tiempo ha sido estudiada por oncólogos mientras que los mecanismos subyacentes siguen siendo confusos. Recientemente, nosotros y otros encontraron que un fenómeno llamado inversión de apoptosis conduce a mayor colonización en varios modelos de celular bajo diferentes estímulos. Estudios previos se han centrado en el seguimiento de este proceso in vitro e in vivo; sin embargo, el aislamiento de células real invertidas tiene todavía ser alcanzado, que limita nuestro entendimiento sobre las consecuencias de la revocación de la apoptosis. Aquí, aprovechamos un tinte verde detección de caspasa-3/7 a las células de etiqueta con caspasas activadas después de la inducción de apoptosis. Células con señales positivas se clasifican más lejos hacia fuera por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para la recuperación. Examen bajo microscopia confocal ayuda a confirmar el estado de apoptosis antes de FACS. Un aumento en la colonización se puede atribuir a menudo a la elevación en el porcentaje de células madre de cáncer (CSC)-como las células. Además, dada la heterogeneidad del cáncer de mama, identificando el origen de estas células de CSC-como sería fundamental para el tratamiento del cáncer. Así, preparamos las células de cáncer no madre mama antes de accionar apoptosis, aislar células caspasa activa y realizar el procedimiento de revocación de la apoptosis. Análisis de citometría de flujo revela que mama CSC-como las células vuelve a aparecerán en el grupo inverso, indicando mama CSC-como las células se transitó de las células de cáncer no madre mama durante apoptosis revocación. En Resumen, este protocolo incluye el aislamiento de apoptotic células de cáncer de mama y la detección de cambios en porcentaje de CSC en células invertidas por citometría de flujo.
Cáncer ha sido la principal causa de muerte, haciendo que la pesada carga a los países a nivel mundial1. El cáncer de mama es alta tanto en términos de incidencia y mortalidad en pacientes femeninos entre todos los tipos de cáncer1. Debido a la heterogeneidad del cáncer, una combinación de fármacos se utiliza generalmente en la quimioterapia para lograr cáncer célula muerte2,3,4. Sin embargo, puesto que los medicamentos quimioterapéuticos comunes a menudo destino ADN5,6, proteína síntesis7,8 o microtúbulos dinámica9, las células de rápido crecimiento son afectados la mayoría mientras que células quiescentes como cáncer células madre (CSC) s son generalmente menos afectados10. CSCs son, por lo tanto, más posibilidades de sobrevivir después del tratamiento, que más adelante conduce a resistencia a los medicamentos y el cáncer recidiva10,11. Por lo tanto, eliminación del CSC se ha convertido en un tema importante para el tratamiento del cáncer y estudio del origen de las CMC es necesario.
Se han realizado más estudios sobre el fenómeno de la reversión de la apoptosis en la última década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes de la aparición de este concepto, ha sido ampliamente aceptado que las células irreversiblemente sufrirá apoptosis después de la activación de caspasas. Caspasas son una familia de enzimas de proteína que desempeñan papeles claves en las etapas de iniciación y ejecución de la apoptosis, incluyendo la formación de la apoptosis complejas y la división de downstream sustratos20. Activación de las caspasas verdugo como caspasa 7 caspasa 3 ha sido considerada como el “punto de no retorno” para apoptosis21. Sin embargo, los investigadores observaron recientemente que apoptosis revocación ocurre in vitro y en vivo, en que las células pueden recuperar de apoptosis incluso después de la activación de caspasa12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. por otra parte, de características agresivas tales como mayor resistencia a la original inductor de apoptosis y mayor invasividad se detectan en el cáncer invertido células15. Por lo tanto, se propuso que el porcentaje de CSC-como las células sería mayor en la población invertida en comparación con las células sin tratar, eventualmente contribuir a las características más malas después de apoptosis revocación18.
Anteriormente, muchos esfuerzos se hicieron un seguimiento de la inversión de apoptosis in vitro y lo más importante, en vivo, que de gran ayuda para confirmar la universalidad de este proceso16,17,19. Sin embargo, carece de un estudio sistémico sobre las consecuencias de las células invertidas debido al aislamiento insuficiente de las células que han sufrido realmente apoptosis revocación. Hay que adquirir las células apoptotic puro y recuperarlos para un estudio más profundo. Por lo tanto, utilizamos el marcador bien aceptado tradicionalmente de la activación de caspasas verdugo como el marcador del “punto de no retorno”21 para apoptosis y utilizar celular activado por fluorescencia (FACS) para discriminar caspase-activado Células teñidas de clasificación con colorante verde detección de caspasa-3/7. El tinte es covalente a una secuencia corta de aminoácidos, DEVD, que puede ser reconocido y hendida por activa caspasas 3/7. El escote ayuda a liberar el tinte, que se translocan desde el citosol al núcleo donde se une al ADN y emite fluorescencia fuerte. Este procedimiento evita el uso de una población de células a granel en la que algunas células pueden no han experimentado apoptosis.
CSC o células iniciadoras del tumor se han identificado en muchos tumores sólidos con una sola o una combinación de varios marcador superficial y muy pocos números de estas células son suficientes para los tumores en ratones inmunodeficientes,22,23, forma 24,25,26,27. Una combinación de CD44 y CD24 se ha utilizado comúnmente en estudios de mama CSC y CD44+/CD24– las células han sido definidas como la mama CSC26,27,28,29 , 30. recientemente, hemos realizado una serie de experimentos para confirmar la relación propuesta entre la revocación de la apoptosis y las CMC y demostrar que las células de cáncer de mama invertida ganaron mayor capacidad de formación de tumor in vitro e in vivo con un elevado porcentaje de células con marcadores de CSC18. Aunque no podríamos excluir la posibilidad de que mama CSCs sobreviven mejores y así conseguirán enriquecidos después de la revocación de la apoptosis, cuando aislamos las células cancerosas no madre y sujeto a revocación del apoptosis, CSC surgirá en el originalmente no-vástago de población de células de cáncer, lo que sugiere que no tallo cáncer de las células pueden contribuir al aumento en el porcentaje de CSC durante apoptosis revocación.
Este artículo pretende demostrar la transición de las células de cáncer no madre mama a Mama CSC-como las células después de la revocación de la apoptosis y detectar esta transición mediante citometría de flujo. Las células de vástago no cáncer de mama se preparan inicialmente aislando CD44–/CD24+ de mama las células cancerosas por FACS. Entonces, apoptosis es inducida y confirmado por cambios morfológicos bajo el microscopio. Luego, las células apoptotic positivamente marcado por el tinte verde detección de caspasas 3/7 son aisladas por FACS y más cultivadas en ausencia de inductores de apoptosis apoptosis inversión. Las células invertidas luego se tiñen con marcadores de CSC después de 7 días de recuperación para el análisis cytometric del flujo. Células con CD44+/CD24– marcadores vuelve a aparecerán en la población invertida, sugiriendo que la transición de las células cancerosas no madre a CSC-como las células ha sufrido durante apoptosis revocación.
Revocación de apoptosis se ha observado en el cáncer de varias líneas celulares como las células normales de primaria tratados con estímulos apoptóticos diferentes en vitro12,13. Este proceso también ha sido trazado en Drosophila en vivo16,17,19del modelo. Toda la información sobre el mecanismo subyacente de la recaída del cáncer en modelos de enfermedad de cáncer diferentes y el origen de las CMC puede obtenerse mediante el uso de la técnica como se describe en este manuscrito.
Este protocolo describe una manera directa y clara para la detección de la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama CSC-como las células como resultado de la revocación de la apoptosis. Confirmación de las propiedades de la CSC de estas células invertidas podría ser asistido usando n vitro mammosphere formación ensayo y en vivo xenograft trasplante en ratones inmunodeficientes18,24,26 </su…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la innovadora tecnología fondo de innovación tecnología de la Comisión: financiamiento de apoyo desde el estado clave de laboratorio de Agrobiotecnología (CUHK), el fondo de investigación biomédica de Lo Kwee-Seong y Lee Hysan Fundación. YX fue apoyado por la beca de postgrado de la CUHK.
MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
Reagent | |||
0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
HEPES | USB | 16926 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
Equipment | |||
100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |