Burada, apoptotik meme kanseri hücreleri floresan aktif hücre sıralayarak yalıtmak ve daha fazla meme kanseri olmayan kök hücreleri meme kanser kök hücre gibi hücrelere geçişten sonra apoptosis ters akış sitometresi tarafından algılamak için bir iletişim kuralı mevcut.
Temel mekanizmaları belirsiz kalırken Kanser nüks onkolog tarafından uzun eğitim gördü. Son zamanlarda, biz ve diğerleri apoptosis ters adında bir fenomen çeşitli hücre modelleri farklı uyaranlara altında artan tumorigenicity yol açar bulundu. Önceki çalışmalarda bu işlem tüp bebek ve içinde vivo izleme üzerinde duruldu; Ancak, yalıtım gerçekten ters hücre elde, hangi anlayışımız apoptosis ters sonuçları üzerinde sınırlar henüz. Burada, biz bir Caspase-3/7 yeşil algılama boya aktif caspases ile etiket hücrelere apoptotik indüksiyon sonra yararlanın. Hücre pozitif sinyaller ile daha da floresan aktif hücre (FACS) kurtarma için sıralama sıralanır. Confocal mikroskobu altında morfolojik muayene apoptotik durumu FACS önce onaylamak yardımcı olur. Tumorigenicity bir artış kez yükselmesi kanser kök hücre (CSC) yüzdesi olarak bağlanabilir-tarihlerde hücreleri. Ayrıca, meme kanseri heterojen göz önüne alındığında, bu CSC benzeri hücreler kaynağını tanımlayan kanser tedavisi için kritik olacaktır. Böylece, meme kanseri olmayan kök hücreleri apoptosis uyarının harekete geçirilmesine karşılık, caspase aktive hücreleri izole ve Apoptozis ters işlemi yapmadan önce hazırlayın. Akış Sitometresi Analizi meme CSC benzeri hücreleri meme CSC benzeri hücreleri apoptosis ters sırasında Meme kanseri olmayan kök hücrelerden aktarıldığı gösteren tersine çevrilmiş grubunda yeniden görünmesini ortaya koymaktadır. Özet olarak, bu iletişim kuralı tarafından akış sitometresi apoptotik meme kanseri hücrelerinin yalıtım ve CSC yüzde ters işlem hücrelerdeki değişiklikler tespiti içerir.
Kanser ülkeler dünya çapında1ağır yükü neden ölüm önde gelen nedenidir olmuştur. Meme kanseri görülme sıklığı ve mortalite açısından hem de kanser1her türlü arasında kadın hastalarda sık ve yaygın yüksek. Kanser heterojenite nedeniyle ilaçlar genellikle kemoterapi kanser hücre ölüm2,3,4elde etmek için kullanılır. Ortak kemoterapötik ilaçlar kez DNA5,6hedef, ancak, hızla büyüyen hücreler9, protein sentezi7,8 ve/veya Mikrotubul dynamics sırasında en etkilenirler durgun kanser kök hücre (CSC) s gibi genellikle daha az etkilenen10hücrelerdir. CSCs vardır, bu nedenle, daha büyük olasılıkla daha sonra neden ilaç direnci ve Kanser nüks10,11tedavi sonrası hayatta kalmak. Bu nedenle, CSCs ortadan kaldırılması kanser tedavisi için önemli bir konu haline gelmiştir ve CSCs kökeni incelenmesi gereklidir.
Apoptozis ters olgusu üzerinde daha fazla çalışmalar son on yılda12,13,14,15,da16,17,18 gerçekleştirilmiş , 19. bu kavramı ortaya çıkması daha önce bu yaygın olarak hücreleri geri dönüşümsüz caspase harekete geçirmek sonra apoptosis geçirecek kabul edildi. Caspases karmaşık apoptotik oluşumu ve aşağı akım yüzeylerde20bölünme gibi apoptozis, başlatma ve yürütme aşamaları kilit rolü oynamak protein enzimler bir aileyiz. Cellat caspases caspase 3 veya caspase 7 gibi aktivasyonu “dönüş yok” apoptoz21olarak kabul edilmiştir. Ancak, araştırmacılar son zamanlarda apoptosis ters tüp bebek her ikisi de oluşur ve sırasında hangi hücrelerin içinde vivo, hatta caspase harekete geçirmek ‘12den sonra,13,14 apoptosis kurtarabilirsiniz gözlenen , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Ayrıca, agresif özellikler daha yüksek direnç özgün apoptotik uyarıcı ve daha yüksek invasiveness algılanır tersine çevrilmiş kanser gibi hücreleri15. Bu nedenle, CSC benzeri hücre yüzdesi daha yüksek sonunda daha malign özellikleri apoptosis ters18sonra katkıda tedavi edilmezse hücrelere kıyasla tersine çevrilmiş nüfus olurdu önerilmiş.
Daha önce birçok çabaları vitro ve daha da önemlisi, apoptozis ters içinde vivo izlemek için büyük ölçüde bu işlemi16,17,19evrenselliğini teyit yardımcı yapılmıştır. Ancak, ters hücre sonuçlarını sistemik bir çalışma nedeniyle gerçekten apoptosis ters uğramıştır hücre yalıtım yetersiz bulunmuyor. Saf apoptotik hücreler almak ve yeniden elde etmek onları için daha fazla çalışma için bir ihtiyaç vardır. Bu sayede apoptosis için “dönüş yok”21 marker olarak geleneksel olarak iyi kabul edilen işaretçiyi cellat caspase etkinleştirme kullanın ve floresan aktif hücre (caspase-aktive hücreleri lekeli ayırımcılık FACS) sıralama kullanmak caspase-3/7 yeşil algılama boya ile. Boya kovalent bir kısa amino asit dizisi, tanınan ve 3/7 active caspases tarafından i ciddi DEVD bağlanır. Bölünme sitozol nerede DNA’yı bağlar ve güçlü floresans yayar çekirdeği translocate boya yayın yardımcı olur. Bu yordamı kullanarak bir toplu hücre nüfus içinde bazı hücreler apoptosis geçirmiş değil önler.
CSCs veya tümör başlatılıyor hücreleri tek bir kullanarak birçok solid tümör tespit edilen veya bir arada çeşitli yüzey marker(s) ve bu hücreler çok az sayıda form tümörler immünyetmezligi fareler22,23için yeterli, 24,25,26,27. CD44 ve CD24 sık meme CSC çalışmalar ve CD44 kullanılmıştır+/CD24– hücreleri meme CSCs26,27,28,29 tanımlanan , 30. son zamanlarda, biz apoptosis ters ve CSCs önerilen ilişkisi onaylamak ve tersine çevrilmiş meme kanseri hücreleri artan tümör şekillendirme yeteneği tüp bebek ve ile vivo kazandı göstermek için deneyler bir dizi gerçekleştirdiyseniz bir CSC işaretleri18hücrelerle yükseltilmiş yüzdesi. Her ne kadar biz değil hariç olasılığını meme CSCs daha iyi hayatta kalmak ve böylece apoptosis ters sonra tekrar ne zaman biz olmayan kök kanser hücreleri ve konu izole olduğunu da önemlisi, zenginleştirilmiş onları apoptosis tersine çevrilmesine, CSC başlangıçta olmayan kök içinde ortaya çıkacak olmayan kanser hücre nüfus, düşündüren kök kanser hücreleri apoptosis ters sırasında CSCs yüzdesi artışa katkıda bulunabilir.
Bu makalede apoptosis ters sonra meme CSC benzeri hücreleri meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş göstermek ve bu geçiş akış sitometresi tarafından tespit etmek için amaçlamaktadır. Meme kanseri olmayan kök hücreleri başlangıçta CD44 izole ederek hazır mısın–/CD24+ meme kanseri hücreleri FACS tarafından. O zaman, apoptozis indüklenen ve morfolojik değişiklikler, mikroskop altında doğruladı. Daha sonra apoptotik hücreler olumlu etiketli-Caspase 3/7 yeşil algılama boya tarafından FACS tarafından izole ve daha da apoptotik indükleyicileri apoptosis ters için yokluğunda kültürlü. Tersine çevrilen hücreleri CSC işaretleri ile akış sitometrik çözümlemesi için kurtarma 7 gün sonra lekeli. CD44 hücrelerle+/CD24 yeniden tersine çevrilmiş nüfus– işaretçileri görünür düşündüren CSC benzeri hücreleri olmayan kök kanser hücrelerinin geçiş apoptosis ters sırasında oluştu.
Apoptozis ters birden fazla kanseri gözlenen yanı sıra normal primer hücre hücre hatları ile in vitro12,13farklı apoptotik uyaranların tedavi. Bu işlem aynı zamanda Drosophila içinde takip edilmiştir içinde vivo16,17,19model. Temel mekanizma ile ilgili fazla bilgi Kanser nüks farklı kanser hastalığı modelleri ve CSCs kökeni bu el yazması açıklandığı gibi tekniği kullanılarak elde edilebilir.
Bu iletişim kuralı meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş meme CSC benzeri hücrelere apoptosis ters bir sonucu olarak algılamak için doğrudan ve net bir şekilde açıklar. Tersine çevrilen bu hücreler CSC özelliklerinin onay immünyetmezligi fareler18,24,26 benn in vitro mammosphere oluşumu tahlil ve in vivo xenograft nakli kullanarak yardımcı ,27,</su…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser yenilikçi teknoloji Fonu yenilik teknoloji Komisyonu tarafından desteklenen: finansman desteği devlet anahtar laboratuvar, Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong Biyomedikal Araştırma Fonu ve Lee Hysan Vakfı. Y.X. CUHK üzerinden yüksek lisans öğrencilik tarafından desteklenmiştir.
MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
Reagent | |||
0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
HEPES | USB | 16926 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
Equipment | |||
100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |