Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare cellule di carcinoma mammario apoptotica ordinando di fluorescenza-attivato delle cellule e ulteriormente rilevare la transizione delle cellule staminali non cancro al seno al seno cancro cellule staminali-come le cellule dopo inversione di apoptosi mediante citometria a flusso.
Abstract
Recidiva del tumore lungo è stato studiato dagli oncologi, mentre i meccanismi di fondo rimangono poco chiari. Recentemente, abbiamo e altri trovato che un fenomeno denominato apoptosi inversione porta ad aumento tumorigenicità in vari modelli di cellulari sotto diversi stimoli. Gli studi precedenti si sono concentrati sul monitoraggio di questo processo in vitro e in vivo; Tuttavia, l’isolamento di cellule vero invertite ha ancora da conseguire, che limita la nostra comprensione sulle conseguenze dell’inversione di apoptosi. Qui, approfittiamo di una tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione alle cellule di etichetta con caspasi attivate dopo induzione apoptotica. Cellule con segnali positivi sono ulteriormente separate per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per il recupero. L’esame morfologico sotto microscopia confocale aiuta a verificare lo stato di apoptotic prima FACS. Un aumento di carcinogenicità spesso può essere attribuito all’elevazione della percentuale di cellule staminali tumorali (CSC)-come le cellule. Inoltre, data l’eterogeneità di cancro al seno, identificare l’origine di queste cellule di CSC-come sarebbe fondamentale per il trattamento del cancro. Così, prepariamo le cellule staminali non cancro al seno prima di innescare l’apoptosi, isolare cellule caspase-attivata ed eseguire la procedura di inversione di apoptosi. Analisi di citometria a flusso rivela che i CSC-come le cellule del seno ri-appaiono nel gruppo invertito, che indica i CSC-come le cellule del seno sono transitate da cellule staminali non cancro al seno durante l’inversione di apoptosi. Questo protocollo prevede in sintesi, l’isolamento delle cellule di cancro al seno apoptotica e rilevamento delle modifiche in percentuale di CSC in cellule invertite tramite flusso cytometry.
Introduction
Cancro è stato delle cause principali di morte, causando il pesante fardello di paesi in tutto il mondo1. Cancro al seno truppa alta sia in termini di incidenza e mortalità in pazienti femminili tra tutti i tipi di cancro1. A causa dell’eterogeneità di cancro, una combinazione di farmaci è solitamente utilizzata in chemioterapia per raggiungere cancro delle cellule morte2,3,4. Tuttavia, poiché le droghe chemioterapeutiche comuni spesso target DNA5,6, proteina sintesi7,8 e/o microtubule dynamics9, cellule in rapida crescita sono interessati più mentre cellule quiescenti come cancro cellule staminali (CSC) s sono solitamente meno colpiti10. CSC sono, pertanto, più probabilità di sopravvivere dopo il trattamento, che poi conduce a farmacoresistenza e cancro recidiva10,11. Quindi, eliminazione delle CSCs è diventata un tema importante per il trattamento del cancro e lo studio dell’origine delle CSCs è necessario.
Sono stati effettuati ulteriori studi sul fenomeno dell’inversione di apoptosi nella decade recente12,13,14,15,16,17,18 , 19. prima della nascita di questo concetto, è stato ampiamente accettato che le cellule irreversibilmente subirà apoptosi dopo l’attivazione delle caspasi. Caspasi sono una famiglia di enzimi proteine che giocano un ruolo chiave nelle fasi di iniziazione e l’esecuzione dell’apoptosi, tra cui la formazione del complesso apoptotico e la fenditura di substrati a valle20. L’attivazione delle caspasi boia come caspasi 3 o caspasi 7 è stato considerato come il “punto di non ritorno” per apoptosi21. Tuttavia, i ricercatori hanno recentemente osservato che l’apoptosi inversione si verifica sia in vitro e in vivo, , durante il quale le cellule possono recuperare dall’apoptosi anche dopo l’attivazione di caspasi12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Inoltre, caratteristiche aggressive come maggiore resistenza alla originale induttore apoptotico e maggiore invasività vengono rilevati nel cancro invertito cellule15. Quindi, è stato proposto che la percentuale di CSC-come le cellule sarebbe superiore alla popolazione invertita rispetto alle cellule non trattate, contribuendo alla fine alle funzionalità più maligna dopo apoptosi inversione18.
In precedenza, molti sforzi sono stato apportati traccia l’inversione di apoptosi in vitro e ancora più importante, in vivo, che notevolmente aiutare a confermare l’universalità di questo processo16,17,19. Tuttavia, uno studio sistematico sulle conseguenze delle cellule invertite è carente a causa dell’isolamento insoddisfacente delle cellule che hanno effettivamente subito inversione di apoptosi. C’è la necessità di acquisire le cellule apoptotiche puro e recuperarli per ulteriore studio. Così, usiamo il marcatore tradizionalmente ben accettato di attivazione delle caspasi boia come l’indicatore del “punto di non ritorno”21 per apoptosi e utilizzare fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per discriminare caspase-attivata cellule colorate con la tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione. La tintura è covalentemente ad una sequenza di amminoacido breve, DEVD, che può essere riconosciuto e spaccati di caspases attivi 3/7. Il clivaggio aiuta a rilasciare il colorante, che sarà traslocano dal cytosol al nucleo dove si lega al DNA ed emette fluorescenza forte. Questa procedura evita di utilizzare una popolazione delle cellule di massa in cui alcune cellule possono non aver subito l’apoptosi.
CSC o cellule d’inizio del tumore sono state identificate in molti tumori solidi, utilizzando un singolo o una combinazione di diversi marker(s) superficiale e molto pochi numeri di queste cellule sono sufficienti a formare tumori in topi immunodeficienti22,23, 24,25,26,27. Una combinazione di CD44 e CD24 è stato comunemente utilizzata negli studi di seno CSC e CD44+/CD24– cellule sono state definite come il seno di CSCs26,27,28,29 , 30. recentemente, abbiamo effettuato una serie di esperimenti per confermare il rapporto proposto tra apoptosi inversione e CSCs e dimostrare che cellule di carcinoma mammario invertita acquisito capacità aumentata di formazione del tumore in vitro e in vivo con un elevata percentuale di cellule con CSC marcatori18. Anche se non potremmo escludere la possibilità che al seno CSCs sopravvivono meglio e così arricchirsi dopo inversione di apoptosi, cosa importante, quando isoliamo le cellule tumorali staminali non e soggetto a inversione di apoptosi, CSC emergerà nell’originariamente non-staminali popolazione delle cellule di cancro, suggerendo che non-staminali cancro cellule possono contribuire all’aumento della percentuale di CSCs durante l’inversione di apoptosi.
Questo articolo si propone di dimostrare la transizione da cellule staminali non cancro al seno alle cellule simil-CSC del seno dopo l’inversione di apoptosi e di rilevare questa transizione tramite flusso cytometry. Le cellule staminali non cancro al seno sono inizialmente preparate isolando CD44–/CD24+ cancro cellule di FACS al seno. Quindi, apoptosi sono indotta e confermata da cambiamenti morfologici sotto il microscopio. In seguito, le cellule apoptotiche positivamente etichettati da tintura verde rilevazione di Caspase 3/7 sono isolate da FACS e ulteriormente coltivate in assenza di induttori apoptotici per l’inversione di apoptosi. Le cellule invertite sono poi tinto con marcatori di CSC dopo 7 giorni di recupero per l’analisi cytometric di flusso. Cellule con CD44+/CD24 marcatori– ri-appaiono nella popolazione invertita, suggerendo che la transizione dalle cellule tumorali staminali non a CSC-come le cellule si è verificato durante l’apoptosi inversione.
Inversione di apoptosi è stata osservata nel cancro più linee cellulari come pure le cellule primarie normali trattati con stimoli apoptotici diversi in vitro12,13. Questo processo è stato rintracciato anche in Drosophila modello in vivo16,17,19. Molte informazioni per quanto riguarda il meccanismo di fondo di ricaduta del cancro nei modelli differenti del cancro malattia e l’origine delle CSCs possono essere ottenuti attraverso l’uso della tecnica come descritto in questo manoscritto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un modo diretto e chiaro per rilevare il passaggio di cellule staminali non cancro al seno in seno CSC-come le cellule come conseguenza di inversione di apoptosi. Conferma delle proprietà CSC di queste cellule invertite potrebbe essere assistito tramite in vitro mammosphere formazione dosaggio ed in vivo dello xenotrapianto trapianto in topi immunodeficienti18,24,26 ,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla innovativa tecnologia fondo di innovazione tecnologia Commissione: supporto finanziamenti dal laboratorio chiave dello stato di Istittuto (CUHK), al fondo di ricerca biomedica Lo Kwee-Seong e Lee Hysan Foundation. Y.X. è stato sostenuto da studentship post-laurea dal CUHK.
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
- Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
- Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
- Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
- Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
- Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
- Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
- Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
- Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
- Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
- Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
- Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
- Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
- Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
- Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
- Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
- Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
