Summary

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Published: January 26, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ולגלות עוד יותר את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד השד תאים סרטניים, כמו בתאי גזע לאחר היפוך אפופטוזיס מאת cytometry זרימה.

Abstract

הישנות סרטן זמן נחקרה על ידי אונקולוגים בעוד המנגנון המשמש כבסיס אינן ברורות. לאחרונה, אנחנו ואחרים מצאו כי תופעה בשם אפופטוזיס היפוך מוביל tumorigenicity מוגברת בדגמי תא שונים תחת גירויים שונים. מחקרים קודמים כבר התמקדו מעקב אחר תהליך זה במבחנה, אין ויוו; עם זאת, הבידוד של תאים הפוכה ממש טרם ניתן להשיג, אשר מגביל את ההבנה שלנו על ההשלכות של היפוך אפופטוזיס. כאן, אנו לנצל צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 לתאים תווית עם caspases מופעל לאחר מוות אינדוקציה. תאים עם אותות חיוביים מסודרים נוספת על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עבור שחזור. בדיקת מורפולוגיה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית מסייע לאשר את מצב אפופטוטיים להיפגע לפני FACS. עלייה tumorigenicity לעתים קרובות ניתן לייחס את העלאת באחוזים של תאי סרטן (CSC)-כמו תאים. כמו כן, לאור את הטרוגניות של סרטן השד, זיהוי המקור של תאים אלה CSC דמוי יהיה קריטי לטיפול בסרטן. לפיכך, אנו מכינים תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לפני מפעילה אפופטוזיס, לבודד תאים קספאז מופעל, ביצוע הליך היפוך אפופטוזיס. ניתוח cytometry זרימה מגלה כי תאים דמויי CSC בשד מחדש יופיעו בקבוצה הפוכה, המציין תאים דמויי CSC בשד הם transited מתאי גזע ללא סרטן השד במהלך היפוך אפופטוזיס. לסיכום, פרוטוקול זה כולל את ניתוקה של תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע וזיהוי של שינויים באחוזים CSC בתאים הפוכה על ידי cytometry זרימה.

Introduction

סרטן כבר מובילה סיבת המוות, גורם מהווה נטל כלכלי כבד על מדינות ברחבי העולם1. סרטן השד מדרג גבוה מבחינת שכיחות ותמותה בחולים הנשי בין כל סוגי הסרטן1. בשל הטרוגניות סרטן, בשילוב של תרופות בדרך כלל משמש כימותרפיה כדי להשיג סרטן התא מוות2,3,4. עם זאת, מאז תרופות כימותרפיות נפוצים לעתים קרובות למקד דנ א5,6, חלבון סינתזה7,8 ו/או microtubule dynamics9, במהירות גוברת תאים הם מושפעים ביותר בזמן השבתה הדרגתית תאים כגון סרטן תאי גזע (CSC) s הם בדרך כלל פחות מושפעת10. CSCs הם, לפיכך, סביר יותר לשרוד לאחר הטיפול, כשבסופו מאוחר יותר עמידות לתרופות, סרטן נסיגה10,11. ומכאן, חיסול של CSCs הפך להיות נושא חשוב לטיפול בסרטן, המחקר על המקור של CSCs הוא הכרחי.

מחקרים נוספים על התופעה של אפופטוזיס היפוך בוצעו ב מהעשור האחרון12,13,14,15,16,17,18 , 19. לפני הופעתה של המושג הזה, זה נרחב התקבלה כי תאים בלתי הפיך עוברים אפופטוזיס לאחר קספאז ההפעלה. Caspases הם משפחה של אנזימים חלבונים ממלאים תפקידים מרכזיים בשלבים ייזום וביצוע של אפופטוזיס, כולל את היווצרות מוות מורכבים, את המחשוף של סובסטרטים במורד הזרם20. הפעלה של התליין caspases כגון קספאז 3 או קספאז 7 נחשב כמו “נקודת האל חזור” אפופטוזיס21. עם זאת, החוקרים לאחרונה הבחינו כי היפוך אפופטוזיס מופיעה במבחנה, ויוו, במהלך אילו תאים יכולים להתאושש אפופטוזיס גם לאחר קספאז הפעלה12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. יתר על כן, תכונות אגרסיביות כגון עמידות גבוהה יותר משרן אפופטוטיים להיפגע המקורי, invasiveness גבוהה יותר מזוהים ב סרטן הפוכה תאים15. לפיכך, הוצע כי אחוז תאים דמויי CSC יהיה גבוה יותר בקרב האוכלוסייה הפוך בהשוואה לתאי לא מטופל, בסופו של דבר לתרום התכונות מהעטלפים לאחר היפוך אפופטוזיס18.

בעבר, מאמצים רבים נעשו כדי לעקוב אחר אפופטוזיס היפוך במבחנה וחשוב יותר, אין ויוו, אשר במידה רבה לעזור המאשרת האוניברסליות של זה תהליך16,17,19. עם זאת, מחקר מערכתית על ההשלכות של תאים הפוכה לוקה בחסר בשל הבידוד משביעת רצון של תאים שעברו באמת היפוך אפופטוזיס. אין צורך לרכוש בתאים אפופטוטיים להיפגע טהור ולשחזר אותם ללימוד נוסף. לפיכך, אנו להשתמש בסמן באופן מסורתי מקובל היטב של התליין קספאז הפעלת הסמן של ה “נקודת האל חזור”21 של אפופטוזיס ולנצל תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) להפלות מופעל קספאז תאים צבעונית עם צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7. לצבוע מקושר covalently רצף של חומצות אמיניות קצר, DEVD, אשר ניתן לזהות ביקע מאת פעיל caspases 3/7. המחשוף מסייעת לשחרור לצבוע, אשר translocate מ ציטוזול את הגרעין איפה זה נקשר ל- DNA ופולט קרינה פלואורסצנטית חזקה. נוהל זה מונע שימוש בצובר תא אוכלוסייה שבו כמה תאים עשויים לא עברו אפופטוזיס.

CSCs או תאי הגידול. מתחילה זוהו בגידולים מוצקים רבים באמצעות יחיד או שילוב של מספר marker(s) משטח ומספרים מעט מאוד של תאים אלה מספיקים כדי טופס גידולים עכברים immunodeficient22,23, 24,25,26,27. שילוב של CD44 CD24 כבר בשימוש נפוץ מחקרים השד CSC, CD44+/CD24 תאים הוגדרו השד CSCs26,27,28,29 , 30. לאחרונה, ערכנו סדרת ניסויים כדי לאשר את היחסים המוצע בין היפוך אפופטוזיס CSCs ומדגימים כי תאים סרטניים בשד הפוכה צבר מוגברת להיוות הגידול היכולת במבחנה ויוו עם אחוז גבוה של תאים עם סמנים CSC18. למרות שאנחנו לא יכול לכלול את האפשרות כי השד CSCs לשרוד טוב יותר, ובכך להשיג מועשר לאחר היפוך אפופטוזיס, חשוב, כאשר אנחנו לבודד תאים סרטניים שאינם-גזע ונושא אותם אפופטוזיס היפוך, CSC יתעוררו בגזע במקור הלא- אוכלוסיית תאים סרטן, רומז הלא-גזע סרטן תאים יכולים לתרום העלייה באחוזים של CSCs במהלך היפוך אפופטוזיס.

מאמר זה מטרתו להדגים את המעבר מתאי גזע ללא סרטן השד תאים דמויי CSC בשד לאחר היפוך אפופטוזיס, לזהות מעבר זה על-ידי cytometry זרימה. תאים שאינם-גזע סרטניים בשד מוכנים בתחילה על-ידי בידוד CD44/CD24+ השד תאים סרטניים על ידי FACS. לאחר מכן, אפופטוזיס הוא המושרה, אושר על ידי שינויים מורפולוגיים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, בתאים אפופטוטיים להיפגע מתויג באופן חיובי על ידי צבע ירוק זיהוי קספאז 3/7 מבודדת על ידי FACS, תרבותי נוסף בהיעדר אפופטוטיים להיפגע inducers עבור היפוך אפופטוזיס. התאים הפוך ואז מוכתמים CSC סמני לאחר 7 ימים של החלמה לניתוח cytometric זרימה. תאים עם CD44+/CD24 סמנים מחדש מופיעים באוכלוסייה הפוכה, רומז כי המעבר מתאי גזע ללא סרטן תאים דמויי CSC אירעה במהלך היפוך אפופטוזיס.

היפוך אפופטוזיס נצפתה סרטן מרובות שורות תאים, כמו גם תאים נורמליים העיקרי מטופלים עם גירויים שונים מוות חוץ גופית12,13. תהליך זה גם הוביל ב דרוזופילה דגם ויוו16,17,19. ניתן לקבל הרבה מידע לגבי המנגנון הבסיסי של relapse סרטן מודלים מחלות סרטן שונות, המקור של CSCs באמצעות הטכניקה כמתואר בכתב היד.

Protocol

1. הכנת השד הלא-גזע תאים סרטניים תרבות MCF-7, מד א-MB-231 בתאים 10 מ”ל נטולת פנול אדום בינוני רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) בקערה 100 מ מ. תרבות T47D ב- 10 מ”ל נטולת פנול אדום בינוני RPMI 1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין, 10% חום-להשבית FBS, ו- 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין…

Representative Results

על מנת לצפות את המעבר מן השד הלא-גזע תאים סרטניים לתאי CSC, כמו השד, מיון הראשון של CD44–/CD24+ תאים סרטניים בשד היו נחוצים. עבור שורת תאים MCF-7, אשר בסביבות 0.15% תאים עם סמנים CSC בקרב האוכלוסייה המקורית (איור 1), שלב זה עזר לא לכלול את האפשרות של CSC העשרה במ?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה ישירה וברורה לגילוי את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לתאים CSC, כמו השד כתוצאה היפוך אפופטוזיס. אישור של CSC מאפייני תאים הפוכה אלה יכול להיות בסיוע באמצעות אניחוץ גופית n mammosphere היווצרות assay, ויוו xenograft השתלת עכברים immunodeficient18,24<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי חדשני בטכנולוגיית קרן של חדשנות טכנולוגיה הנציבות: מימון תמיכה של המדינה מפתח מעבדה של Agrobiotechnology (CUHK), קרן מחקר Lo ביו Kwee-סאונג, קרן Hysan לי. Y.X. נתמכה על ידי studentship לתואר שני מ- CUHK.

Materials

MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40-μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006

References

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
check_url/58642?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Xu, Y., So, C., Lam, H., Fung, M., Tsang, S. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).

View Video