Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות
Summary
אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.
Abstract
כימות של חלבונים עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE) היא חשובה קלינית ומחקר יישומי. שיטה אופטימלית של כימות מדויק, יש טווח דינמי רחב ליניארי ושומר את השלמות. המבנית של המדגם כדי לאפשר זיהוי של סוגי תאים בודדים. שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC), ספקטרומטר מסה immunoblotting אחד לא לעמוד תנאים אלה בשל טבעם קטגורית או homogenize את הדגימה. כאמצעי חלופי, אנו מציעים את השימוש immunofluorescence (אם) וניתוח התמונה כדי לקבוע את השפע היחסי של חלבון עניין ברקמות FFPE. בזאת אנחנו מדגימים כי שיטה זו ממוטבת בקלות, התשואות טווח דינמי רחב, והוא באופן ליניארי לכימות לעומת תקן הזהב של immunoblotting כמותיים. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת שמירה על שלמות המבנה של המדגם ומאפשר ההבחנה של סוגי תאים שונים, אשר עשוי להיות מכריע ביישומים אבחון. בסך הכל, זהו שיטה חזקה כימות היחסי של חלבונים בדגימות FFPE והוא ניתן להתאים בקלות להתאים קליני או מחקר צרכים.
Introduction
הצורך לכמת חלבונים בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע של דגימות ביופסיה של (FFPE) רקמה קיים בתחומים רפואיים רבים. לדוגמה, כימות של חלבונים סמן בדגימות ביופסיה שגרתית משמש כדי להבהיר פרוגנוזה ולהודיע טיפול עבור סרטן המטופלים1. עם זאת, שיטות הם בדרך כלל סובייקטיבי, חוסר אימות.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמש באופן שגרתי במעבדות פתולוגיה, תלוי בדרך כלל של נוגדן ראשוני מכוונים את חלבון המטרה של נוגדנים משניים מצומדת עם תווית אנזימטי כגון חזרת peroxidase2. IHC קונבנציונלי הוא רגיש, יכול לעשות שימוש של דקה דגימות ושומר על שלמות מורפולוגי של דגימות רקמה ובכך מאפשרת הערכה של חלבון הביטוי בתוך ההקשר היסטולוגית הרלוונטיות שלה. עם זאת, מכיוון שהאות הדפסות כסף שנוצר על ידי IHC מופחתים, הוא סובל טווח דינמי צר יחסית, ומציע פוטנציאל מוגבל ריבוב2,3,4. לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI-MSI) שומר על הגינות מורפולוגית. אולם, זו הטכנולוגיה המתפתחת מזוהה עם רזולוציה מורפולוגי צנוע, דורש כיול משמעותית, נורמליזציה, ופוגע שלה היתכנות לשימוש קליני5,6,7. טכניקות חלופיות לכמת חלבון דגימות רקמה כוללים immunoblotting8, ספקטרומטר מסה9,10,11, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)12, כל של שמתחיל עם הומוגני lysate של דגימת רקמה. דגימות רקמה הראשי הם הטרוגנית כי הם מכילים שפע של סוגי תאים. לכן, טכניקות שכרוכים homogenizing את הדוגמאות אינן מתירות כימות של חלבון באוכלוסייה לתא מסוים עניין כגון תאים סרטניים.
כאילו IHC, אם הוא ישים קטן FFPE דוגמאות וההיתרים השמירה של שלמות היסטולוגית13. עם זאת, תודה לטבע מוספים של אותות פלורסצנטיות, אם הוא נוטה היישום של מספר נוגדנים העיקרי ותוויות פלורסנט. לפיכך, חלבון עניין עשוי להיות יחסית לכמת בתוך תאים ספציפיים או תאים סלולריים (לדוגמה, גרעין לעומת הציטופלסמה) המוגדרים באמצעות נוגדנים אחרים. קרינה פלואורסצנטית אותות גם יש את היתרון של13,טווח דינמי גדול14. עליונות הפארמצבטית, ריבוב הפוטנציאל של אם מוחל על דגימות FFPE כבר הפגינו13,14,15.
במסמך זה אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים באמצעות שורות תאים הוקמה כמו תקן הזהב כדי לברר את מהות כמותיים אם בשילוב עם ניתוח תמונות המחשב בסיוע בקביעת שפע יחסי של חלבון עניין ב- סעיפים היסטולוגית של דגימות רקמה FFPE. לנו יש להחיל שיטה זו בהצלחה בגישה מולטיפלקס לכמת חלבונים סמן קליני ביופסיה דגימות16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
תארנו שיטה לשימוש immunoblotting כמותית (ליברות) כדי להדגים את התועלת של immunofluorescence (אם) עבור ברור שפע יחסי של חלבון המטרה דגימות רקמה FFPE. שיטות הנוכחי של כימות חלבונים מוגבלים לפי טבעם קטגורית, כגון2,הדפסות כסף IHC3, או בצורך homogenize דגימות, מניעת חקירה דוגמת מבנה ותא הא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרדריק בנטינג ו צ’ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני מלגה (בבוקר).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
