Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina
Summary
Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.
Abstract
Cuantificación de proteínas de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE) es importante en clínica y aplicaciones de la investigación. Un método óptimo de cuantificación es preciso, tiene un rango dinámico lineal amplio y mantiene la integridad estructural de la muestra para permitir la identificación de tipos de células individuales. Los métodos actuales como la inmunohistoquímica (IHQ), espectrometría de masas y immunoblotting cada uno no cumplan con estas disposiciones debido a su naturaleza categorial o necesitan homogeneizar la muestra. Como método alternativo, proponemos el uso de inmunofluorescencia (IF) y análisis de imagen para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en los tejidos FFPE. Aquí se demuestra que este método se optimiza fácilmente, produce un amplio rango dinámico y es linealmente cuantificable en comparación con el estándar de oro de immunoblotting cuantitativa. Además, este método permite el mantenimiento de la integridad estructural de la muestra y permite la distinción de varios tipos de células, que puede ser crucial en aplicaciones de diagnóstico. En general, esto es un método robusto para la cuantificación relativa de proteínas en muestras FFPE y puede adaptarse fácilmente para adaptarse a clínica o investigación necesidades.
Introduction
Existe la necesidad de cuantificar proteínas en muestras de biopsia de tejido de (FFPE) de formalina-fijos, parafina-encajado en muchos campos clínicos. Por ejemplo, cuantificación de proteínas biomarcadoras en especímenes de la biopsia de rutina se utiliza para aclarar el pronóstico y tratamiento para pacientes de cáncer1de informar. Sin embargo, los métodos actuales son generalmente subjetivos y carecen de validación.
Inmunohistoquímica (IHC) es utilizado rutinariamente en laboratorios de patología y generalmente depende de un anticuerpo primario contra la proteína diana y un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta enzimática como la peroxidasa de rábano picante2. IHC convencional es sensible, puede hacer uso de minutos de muestras y preserva la integridad morfológica de muestras de tejido, lo que permite la evaluación de la expresión de la proteína dentro de su contexto histológica relevante. Sin embargo, porque la señal cromogénica generada por IHC es sustractiva, se adolece de un relativamente estrecho rango dinámico y ofrece un potencial limitado de multiplexación2,3,4. Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MSI) la proyección de imagen preserva integridad morfológica. Sin embargo, este desarrollo de la tecnología está asociado con una modesta resolución morfológica y requiere calibración significativo y normalización, de afectar su viabilidad para el uso clínico rutinario5,6,7. Técnicas alternativas para cuantificar proteínas en muestras de tejido son immunoblotting8, espectrometría de masas en9,10,11y enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo12, cada de que comienza con un homogeneizado lisado del tejido de la muestra. Las muestras de tejido primario son heterogéneas que contienen una multitud de tipos celulares. Por lo tanto, técnicas que implican la homogeneización de las muestras no permiten la cuantificación de una proteína en una población celular particular de interés, como las células cancerosas.
Como IHC, si es aplicable a las pequeñas muestras de FFPE y permite la retención de la integridad histológica13. Sin embargo, gracias a la naturaleza aditiva de las señales de fluorescencia, si es favorable a la aplicación de múltiples anticuerpos primarios y etiquetas fluorescentes. Por lo tanto, una proteína de interés se puede cuantificarse relativamente dentro de compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo y citoplasma) definidas por medio de otros anticuerpos o de células específicas. Señales de fluorescencia también tienen la ventaja de un mayor rango dinámico13,14. La superioridad, la reproducibilidad y la multiplexación potencial de si se aplica a muestras FFPE ha sido demostrada13,14,15.
Adjunto describimos el uso de immunoblotting cuantitativo utilizando las líneas celulares establecidas como patrón oro para determinar la naturaleza cuantitativa de si junto con análisis de imagen asistida por ordenador para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en secciones histológicas de muestras de tejido FFPE. Hemos aplicado este método con éxito en un enfoque múltiple para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia clínica16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un método que hace uso de immunoblotting cuantitativa (IB) para demostrar la utilidad de la inmunofluorescencia (IF) para determinar la abundancia relativa de una proteína diana en muestras de tejido FFPE. Métodos de cuantificación de proteínas actuales están limitados por su naturaleza categorial, como cromógeno IHC2,3, o por la necesidad de homogeneizar las muestras, prevención de la investigación sobre las poblaciones de la célula y es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado parcialmente por el Fredrick Banting y Charles Best Canadá postgrado becas (A.M.).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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