ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット
Summary
ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー タンパク質の相対的な量を判別する蛍光組織学の有用性を示した。
Abstract
ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルの興味の蛋白質の定量化は臨床的に重要なアプリケーションを研究。定量化の最適なメソッドが正確で、線形ダイナミック レンジが広い、個々 のセルの種類を識別するためにできるようにするサンプルの構造の整合性を維持します。免疫組織染色 (IHC)、質量分析法、免疫ブロットなど現在メソッドが各はそのカテゴリの性質のためこれらの規定を満たすために失敗したりサンプルを均質化する必要があります。別の方法として蛍光抗体法 (IF) と画像解析 FFPE 組織の興味の蛋白質の量を決定するための使用を提案します。ここは、このメソッドは簡単に最適化し、広いダイナミック レンジが得られますは定量的免疫ブロットのゴールド スタンダードと比較して直線的に定量化を示します。さらに、このメソッドは、サンプルの構造の整合性の維持が可能、診断アプリケーションで重要となる可能性がありますさまざまなセルタイプの区別のためことができます。全体的にみて、これは FFPE サンプルの蛋白質の相対的な定量化のための堅牢な方法で、簡単に合わせて臨床や研究のニーズに適応することができます。
Introduction
ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織生検試料中のタンパク質を定量化する必要が多くの臨床現場であります。たとえば、ルーチン生検のマーカー蛋白質の定量は予後の解明し、癌患者1の治療に知らせるためです。ただし、現在の方法は通常主観的であり、検証がないです。
免疫組織染色 (IHC) は病理学研究室で日常的に使用、通常ターゲット蛋白質の一次抗体と二次抗体酵素西洋わさびの過酸化酵素2などラベル付き共役によって異なります。従来の IHC は敏感で、作ることができる分の使用サンプルし、その関連する組織コンテキスト内でタンパク質発現の評価が行え組織サンプルの形態学的整合性を維持します。しかし、IHC によって生成された発色の信号は減算、のでそれが比較的狭いダイナミック レンジに苦しんで、2,3、4を多重化するため限られた可能性を提供しています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングには、形態学的整合性が維持されます。しかし、発展するこの技術はささやかな形態の解像度に関連付けられて、大幅な校正と標準化、日常的に臨床使用5,6、7の可能性を損なうことが必要です。組織サンプル中のタンパク質を定量化するための代替技術は、免疫ブロット8質量9,10,11,、酵素免疫測定法 (ELISA)12、各均質化、始まるのサンプル組織ライセート。主な組織サンプルは、細胞の種類の多数を含む異種。したがって、サンプルの均質化を伴う技術が癌細胞のような興味の特定のセル人口のタンパク質の定量を許可しません。
場合、IHC の小に適用できるような FFPE サンプルし、組織学的整合性13の保持が可能します。場合、ただし、蛍光信号の添加物の性質のおかげで複数の一次抗体、蛍光ラベルの適用を受けやすいです。したがって、特定の細胞または細胞コンパートメント (たとえば、核と細胞質) 他の抗体を使用して定義内で比較的興味の蛋白質を定量化することがあります。蛍光信号も大きいダイナミック レンジ13,14の利点があります。優位性、再現性、多重性 FFPE サンプルに適用される場合は、実証された13,14,15をされています。
ここで興味の蛋白質の相対量を決定する際にコンピューター支援画像解析と組み合わされる場合の計量的性質を確認するためのゴールド スタンダードとして確立されたセルラインを使用して定量的免疫ブロットの使用について述べるFFPE 組織サンプルからの組織学的セクション。我々 は臨床の生検サンプル16,17,18バイオ マーカー蛋白質を定量化するための多重アプローチで正常にこのメソッドを適用しました。
Protocol
主な人体組織サンプルを使用する健康科学関連教育病院研究倫理委員会 (HSREB) 女王の大学から承認されました。 1. 細胞ティッシュのマイクロ アレイ (TMA) の構築 収穫や洗浄のセルです。注: このプロトコルは、様々 な確立の不死化細胞株 (例えばhela 細胞の Jurkat、RCH ACV) でテストされています。 付着性のセルの約 80% の confluency に達すれば約 1.3 倍…
Representative Results
このプロトコルは FFPE 組織ブロック化細胞において抗アポトーシス蛋白 Bcl 2 の相対的な量を決定する場合の機能を確認するために使用されました。がん細胞に選択的に定量化 Bcl 2 発癌機構を解明することができますおよび病理組織学的診断と臨床管理決定24を通知に便利することができます。具体的には、Bcl 2 適切な b リンパ球の開発の役割を果た…
Discussion
については、メソッドを利用する定量的免疫ブロット (IB) 蛍光抗体法 (IF) の有用性を実証する FFPE 組織サンプルのターゲット蛋白質の相対的な豊かさを判別します。現在蛋白質定量方法が発色 IHC2,3などそのカテゴリ性質またはサンプル、サンプル構造と細胞集団に調査を防止するなどを統一する必要性によって限られています。IB と質量<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はフレドリック バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金 (午前) 部分的に資金を供給されました。
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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Cite This Article
Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, S., LeBrun, D. P. Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples. J. Vis. Exp. (143), e58735, doi:10.3791/58735 (2019).