Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina
Summary
Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.
Abstract
Quantificação de proteínas de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) é importante na clínica e aplicações de pesquisa. Um método ideal de quantificação é exato, tem uma ampla gama de dinâmica linear e mantém a integridade estrutural da amostra para permitir a identificação dos tipos de células individuais. Métodos atuais como imuno-histoquímica (IHC), espectrometria de massa e immunoblotting cada um não cumprem estas estipulações devido à sua natureza categórica ou necessidade de homogeneizar a amostra. Como um método alternativo, propomos a utilização de análise de imagem para determinar a abundância relativa de uma proteína de interesse em tecidos FFPE e imunofluorescência (IF). Neste documento vamos demonstrar que este método é facilmente otimizado, produz uma ampla faixa dinâmica e é linearmente quantificável em comparação com o padrão-ouro de immunoblotting quantitativa. Além disso, este método permite a manutenção da integridade estrutural da amostra e permite a distinção de vários tipos de células, que pode ser crucial em aplicações diagnósticas. Globalmente, este é um método robusto para a quantificação relativa de proteínas nas amostras FFPE e pode ser facilmente adaptado para atender clínicas ou as necessidades de investigação.
Introduction
A necessidade de quantificar proteínas no formalin-fixas, parafina amostras de biópsia de tecido (FFPE) existe em muitos campos clínicos. Por exemplo, quantificação de proteínas biomarcador em espécimes de biópsia de rotina é usada para elucidar o prognóstico e informar o tratamento para pacientes de câncer1. No entanto, métodos atuais são tipicamente subjetivos e faltam de validação.
Imuno-histoquímica (IHC) é usado rotineiramente em laboratórios de patologia e geralmente depende de um anticorpo primário dirigidas a proteína do alvo e um anticorpo secundário conjugado com um rótulo enzimático, tais como a peroxidase de rábano2. IHC convencional é sensível, pode fazer uso de minuto amostras e preserva a integridade morfológica de amostras de tecido, permitindo a avaliação da expressão da proteína dentro de seu contexto histológico relevante. No entanto, porque o cromogênico sinal gerado pelo IHC é subtrativo, sofre de uma faixa relativamente estreita dinâmica e oferece um potencial limitado de multiplexação de3,2,4. Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI-MSI) de imagem preserva a integridade morfológica. No entanto, esta tecnologia em desenvolvimento é associada com a modesta resolução morfológica e requer calibração significativa e normalização, prejudicando sua viabilidade para uso clínico rotineiro5,6,7. Técnicas alternativas para quantificar proteínas em amostras de tecido incluem immunoblotting8, espectrometria de massa9,10,11e enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)12, cada de que começa com um homogeneizado lisado de tecido de amostra. Amostras de tecido primário são heterogêneas em que eles contêm uma infinidade de tipos de células. Portanto, técnicas que impliquem a homogeneização das amostras não permite a quantificação de uma proteína em uma população de célula específica de interesse, tais como células cancerosas.
Como IHC, se é aplicável às pequenas FFPE amostras e permite a manutenção da integridade histológicas13. No entanto, graças à natureza aditiva de sinais de fluorescência, se é passível de aplicação de vários anticorpos primários e etiquetas fluorescentes. Assim, uma proteína de interesse pode ser quantificada relativamente dentro de células específicas ou compartimentos celulares (por exemplo, núcleo e citoplasma) definidos usando outros anticorpos. Sinais de fluorescência também têm a vantagem de uma maior gama dinâmica13,14. A superioridade, reprodutibilidade e multiplexação potencial de se aplicado a amostras FFPE tem sido demonstrada13,14,15.
Neste documento descrevemos o uso de quantitativo immunoblotting utilizando linhagens celulares estabelecidas como padrão ouro para apurar a natureza quantitativa de se juntamente com a análise de imagem computadorizada na determinação da abundância relativa de uma proteína de interesse em cortes histológicos de amostras de tecido FFPE. Nós aplicamos esse método com êxito em uma abordagem multiplex para quantificar proteínas biomarcador em amostras de biópsia clínico16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método que faz uso de immunoblotting quantitativa (IB) para demonstrar a utilidade da imunofluorescência (IF) para determinar a abundância relativa de uma proteína do alvo em amostras de tecido FFPE. Métodos de quantificação da proteína atual são limitados pela sua natureza categórica, como cromogênico IHC32,, ou pela necessidade de homogeneizar as amostras, impedindo a investigação sobre as populações de estrutura e célula de amost…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado pela Fredrick Banting e Charles Best Canadá Graduate Scholarship (A.M.).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
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