使用乌斯蒂拉戈梅迪斯作为特洛伊木马在现场交付玉米蛋白
Summary
这项工作描述了克隆一个 ust原 maydis特洛伊木马菌株, 以便在原地传递分泌的玉米蛋白到三种不同类型的玉米组织。
Abstract
在荷马特洛伊木马神话的启发下, 我们设计了玉米病原体乌斯蒂拉戈·梅迪斯,将分泌的蛋白质传递到玉米注入中, 允许在体内进行表型分析。这种方法不依赖于玉米的转化, 而是利用了微生物遗传学和病原体的分泌能力。在这里, 它允许检查体内提供的分泌的蛋白质与高时空分辨率在不同种类的感染部位和组织。特洛伊木马策略可用于瞬时补充玉米功能损失表型, 功能表征蛋白质域, 分析非目标蛋白效应, 或研究单侧蛋白质过量, 使其成为一个强大的工具玉米作物系统中的蛋白质研究。这项工作包含了一个精确的协议, 如何生成特洛伊木马菌株, 然后是标准化的感染协议, 将这种方法应用于三种不同的玉米组织类型。
Introduction
生物养病原体乌斯蒂拉戈梅迪斯是玉米黑麦病1的病原体。它感染玉米的所有空中部位, 导致大肿瘤, 其中含有黑色素化的黑色孢子。在全球范围内,据估计, 美国梅迪斯每年会造成玉米产量损失 2% 左右, 而在墨西哥, 肿瘤被认为是一种美食。植物感染是由一种附着物引起的, 这种酶分泌细胞壁裂解酶, 以穿透玉米表皮细胞的第一层。从一个主要的感染部位,美国的梅迪斯生长在细胞内和细胞间, 每天侵入一到两个细胞层 1,2。成功的感染导致植物肥大, 在感染后5天变成可见的肿瘤 1,3,4。在所有感染阶段, 真菌菌丝侵入植物细胞质膜, 而不与宿主细胞质1,2有任何直接接触。感染菌丝与植物质膜之间紧密的表质空间被认为是宿主病原体的互动位点, 称为生物养能相互作用区。为了克服植物固有的免疫系统,美国将一系列效应蛋白分泌到生物养相互作用区 1。一些效应被植物细胞吸收, 而另一些效应则留在生物养细胞相互作用区 5、6、7、8。一个热塑性效应器是 umpit2, 它与热塑性玉米蛋白酶相互作用, 通过热塑性蛋白酶活性9,10防止 zmprozip 中的信号肽 zmzip1 的释放。
在过去的几十年里,由于人们对生命周期的了解、遗传的可及性和分泌物的异种表达, 美国梅迪斯不仅成为植物-病原体相互作用中真菌遗传学的典范, 而且成为生物技术中的一个宝贵工具。蛋白质11,12,13。常规和非常规蛋白质分泌的信号已被确定, 允许控制翻译后的修饰 14.最近,美国梅迪斯被用作特洛伊木马工具, 在原地研究小的、分泌的玉米蛋白.成功地应用特洛伊木马方法分析了参与花药发育的小的分泌蛋白 zmmac1 的功能。zmmac1 诱导新形成的细胞15的多能细胞的周周分裂和细胞命运指标.用同样的方法揭示了玉米损伤相关肽 zmzip1 的生物学功能。美国的梅迪斯分泌玉米 zmzip1 导致肿瘤形成受损10。因此, 特洛伊木马方法是一种有价值的替代途径, 可用于具有较高时空分辨率的原位蛋白质研究, 既不需要生成稳定的玉米转化线, 也不需要异源组织浸润表达和纯化的蛋白质。特别是, 特洛伊木马策略使任何异源蛋白分泌到玉米植物体内, 并直接比较同一组织内受感染的植物细胞与未感染的植物细胞。
该协议说明了产生一个美国梅迪斯特洛伊木马菌株来研究感兴趣的蛋白质的主要步骤。它还包括关于三种不同玉米组织类型 (成年叶子、花被和耳朵) 感染程序的准确信息, 这是研究时空感染进展和蛋白质功能的先决条件在这些目标组织中没有对玉米基因扩增和显微成像技术作出进一步的规定, 因为这些步骤是针对特定目标和与仪器有关的。因此, 该协议是针对有经验的标准分子生物学技术的用户。
Protocol
Representative Results
Discussion
现代作物研究需要关于基因和蛋白质水平的分子分析的协议。对于玉米等大多数作物品种来说,通过转化实现遗传可及性是不可用的, 也是效率低下和耗时的。此外, 可靠的遗传工具, 如启动子报告系统, 这使得很难研究在不同的组织部位具有高时空分辨率的原位蛋白功能。光蛋白可以通过异源表达和纯化的蛋白质渗入组织来研究。然而, 尽管异源蛋白表达取得了进展, 但有针对性地渗入作物组…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢托马斯·德雷塞尔豪斯、马丁·帕尼斯克、努雷丁·杰拉和阿明·希尔德布兰德提供的实验室空间和植物材料。关于特洛伊木马方法的最初工作得到了 leopoldina 博士后研究金和 nsf 项目 ios13-9229 的支持。本文介绍的工作得到了 dfg sfb924 (项目 a14 和 b14) 的支持。
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
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