Summary

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Abstract

Homer´s Truva atı mit esinlenerek, Mısır patojen Ustilago maydis salgılanan proteinler içinde vivo fenotipik analiz izin Mısır apoplast sunmak için tasarlanmış. Bu yöntem Mısır dönüşüm üzerinde dayanmaz Ancak mikrobiyal genetik ve patojenlerin salgı yetenekleri olağanüstü başarı. Burada, içinde vivo incelenmesi salgılanan proteinler kronolojik zamanmekansal çözünürlükte yüksek enfeksiyon siteleri ve doku çeşitleri ile teslim sağlar. Truva atı strateji-ebilmek var olmak kullanmak geçici işlevsel olarak protein etki alanları, hedef protein etkilerini incelemek veya ofsayt protein overdosage, güçlü bir araç yapmak için çalışmaya karakterize etmek için Mısır işlev kaybı fenotipleri tamamlayacak protein çalışmaları Mısır ürün sistem. Bu eser üç farklı Mısır doku türü için bu yöntemi uygulamak için standart enfeksiyon protokolleri takip bir Truva atı yük oluşturmak nasıl kesin bir iletişim kuralını içerir.

Introduction

Biotrophic patojen Ustilago maydis Mısır kurum hastalığı1hastalığının olduğunu. Mısır melanized, siyah sporları içeren büyük tümör içinde kaynaklanan tüm hava parçaları bozar. Küresel düzeyde, U. maydis tümörü Meksika’da lezzetin bir incelik olarak takdir edilmektedir iken Mısır verimi, yaklaşık % 2 yıllık bir kaybına neden tahmin edilmektedir. Bitki enfeksiyon Mısır epidermal hücrelerin ilk tabakası nüfuz hücre duvarı lysing enzimler salgılar bir appressorium tarafından başlatılır. Bir birincil enfeksiyon sitesinden bir-iki hücreyi istila katmanlar her gün1,2, intracellularly ve intercellularly U. maydis yetişir. Beş gün üzerine görünür tümör dönüşüyor bitki hipertrofisi sonuçlarında başarılı enfeksiyon enfeksiyon1,3,4posta. Bütün enfeksiyon aşamaları sırasında mantar hif bitki sitoplazma membran ana makine sitoplazma1,2için doğrudan herhangi bir temas olmadan invaginate. Bitki plazma zarı arasındaki bulaşmasını hif sıkı apoplasmic alanı biotrophic etkileşim bölgesi adı verilen ana bilgisayar/patojen interaktif sitesi olarak kabul edilir. Bitki doğuştan gelen bağışıklık sistemi üstesinden gelmek için U. maydis bir dizi efektör proteinlerin biotrophic etkileşim bölgesi1salgılar. Diğerleri biotrophic etkileşim bölgesi5,6,7,8‘ kalır bazı effectors bitki hücreleri tarafından alınır. Bir apoplastic efektör UmPit2, sinyal peptid ZmZIP1 apoplastic proteaz aktivitesi9,tarafından ZmPROZIP üzerinden10sürümü önlemek için apoplastic Mısır proteaz ile etkileşim olduğunu.

Son on yıl boyunca U. maydis mantar genetik bitki patojeni etkileşim içinde aynı zamanda iyi anlaşılmış bir yaşam döngüsü, kolay genetik erişilebilirlik nedeniyle biyoteknoloji değerli bir araç için sadece bir model oldu değil ve kapaklı ifade salgılanan proteinler11,12,13. Her iki geleneksel ve sıradışı protein salgılanması için sinyalleri ardından değişiklikler14kontrol sağlayan tespit edilmiştir. Son zamanlarda, küçük, çalışmaya bir Truva atı araç salgılanan gibi Mısır proteinler in situ15 U. maydis istihdam edildi. Truva atı yaklaşım şekilde küçük, salgılanan protein anter geliştirmede söz konusu ZmMAC1 işlev analiz etmek için kullanıldı. ZmMAC1 pluripotent hücreler ve yeni kurulan hücreleri15hücre kader tayini periclinal bölümü neden olmaktadır. Aynı yöntemle Mısır hasar ilişkili peptid ZmZIP1 biyolojik fonksiyonu ortaya çıktı. ZmZIP1 sonuçlandı Mısır salgılayan U. maydis tümör oluşumu10Engelli. Böylece, Truva atı yaklaşım temsil in situ çalışmalar ne yapar kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüklü protein için değerli bir alternatif yol istemek istikrarlı Mısır dönüştürme satırları ne de doku infiltrasyonu ile nesil heterologously ifade ve saf protein. Özellikle, Truva atı strateji Mısır apoplast kapaklı herhangi bir protein salgılanması ve aynı doku içindeki sigara enfekte bitki hücreleri enfekte karşı doğrudan karşılaştırma sağlar.

Bu iletişim kuralı bir protein ilgi çalışmaya bir U. maydis Truva atı gerginlik getirici için başlıca adımları göstermektedir. Hangi kronolojik zamanmekansal enfeksiyon ilerleme ve protein işlevi eğitim için bir önkoşuldur U. maydisile daha fazla üç farklı Mısır doku türü (yetişkin yapraklar, püsküllü ve kulakları) enfeksiyon yordamları hakkında kesin bilgiler içerir Bu hedef dokulara. Daha fazla hiçbir belirtim Mısır gene amplifikasyon üzerinde verilen ve mikroskobik adımları hedef özgü ve enstrüman bağımlı olduğundan teknikleri, görüntüleme. Böylece, bu iletişim kuralı standart moleküler biyoloji teknikleri deneyimli kullanıcılara yöneliktir.

Protocol

1. bir U. maydis Truva atı inşaatı Not: Bkz: Şekil 1. Bir gen Mısır cDNA gene özgü astar ve proofreading bir DNA polimeraz kullanarak dan ilgi yükseltmek. Birincil PCR ürünü klon ve plazmid satıcının talimatları. E. coli inşa dönüştürmek Faiz sırası Sanger sıralama sonraki klonlama adımlar için kullanmadan önce tarafından doğru gen doğrulayın.Not: PCR özellik…

Representative Results

U. maydis Truva atı deneyler için yapıları plazmid p123-PUmpit2-SpUmpit2-faiz-mCherry gene-Haklonlanır. Mısır gen ilgi mCherry floresan muhabir ve bir epitope HAerimiş-etiket. Özellikle enfeksiyon21sırasında aktif U. maydis Umpit2 Düzenleyicinin kontrolü altında füzyon protein ifadesidir. Biotrophic etkileşim bölgesi…

Discussion

Modern ürün araştırma genetik moleküler analiz ve protein düzeyleri için protokoller talep ediyor. Genetik erişilebilirlik ile dönüşüm kullanılabilir veya verimsiz ve Mısır gibi birçok bitki türünün zaman alıcı değil. Ayrıca, güvenilir genetik organizatörü muhabir sistemleri gibi farklı doku siteleri kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlükte yerinde protein işleviyle çalışmaya zor kılan kıt, araçlardır. Apoplastic protein heterologously ifade ve saf protein infiltrasyo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella ve Armin Hildebrand laboratuvar alanı ve bitki malzeme sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Truva atı yöntemi özgün çalışmalarına Leopoldina postdoc Bursu ve NSF proje IOS13-39229 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede sunulan iş DFG (A14 ve B14 projeler) SFB924 tarafından desteklenmiştir.

Materials

2 mL syringe  B. Braun 4606027V
23G x 1 1/4 hypodermic needle B. Braun 4657640
Bacto Peptone  BD 211677
cDNA from maize from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal Sigma-Aldrich 05105
Confocal laser scanning microscope use locally available equipment
Cuvette (10 x 4 x 45 mm) Sarstedt 67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification use locally available equipment
Nco I NEB R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1mCherry-Ha please contact the corresponding author 
Pasteur pipet (glass, long tip) VWR 14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO Thermo Fisher Scientific K280002 can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar  VWR 90000-745
Sharpie pen use locally available equipment
Spectrophotometer use locally available equipment
Ssp I NEB R0132
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
T4 DNA ligase NEB M0202
TRIS Sigma-Aldrich TRIS-RO
Xba I NEB R0145
Yeast extract  BD 212750

References

  1. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  2. Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
  3. Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
  4. Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
  5. Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
  6. Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
  7. Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
  8. Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
  9. Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
  10. Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
  11. Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
  12. Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
  13. Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
  14. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  15. van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
  16. Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
  17. Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
  18. Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
  19. Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
  20. Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
  21. Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
  22. Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
  23. Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).

Play Video

Cite This Article
Fiedler, I., Weiberg, A., van der Linde, K. Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins. J. Vis. Exp. (144), e58746, doi:10.3791/58746 (2019).

View Video