Mit Ustilago Maydis als ein Trojanisches Pferd für In Situ Lieferung von Mais Proteine
Summary
Diese Arbeit beschreibt das Klonen einer Ustilago Maydis Trojanisches Pferd Belastung für die in-situ Lieferung von sekretierten Proteinen, Mais in drei verschiedene Arten von Mais Gewebe.
Abstract
Von Homers Trojanische Pferd Mythos inspiriert, haben wir den Mais Erreger Ustilago Maydis sekretierten Proteine in den Mais Apoplast schönem in-vivo phänotypische Analyse liefern entwickelt. Diese Methode setzt nicht auf Mais Transformation aber beutet mikrobielle Genetik und sekretorischen Funktionen von Krankheitserregern. Hierin, ermöglicht es, dass Inspektion von in-vivo sekretierten Proteine mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung bei verschiedenen Arten von Infektion Websites und Gewebe geliefert. Die Trojanische Pferd-Strategie kann genutzt werden, um vorübergehend Maize Verlustfunktion-Phänotypen, um funktionell charakterisieren Protein Domänen, aus Zielprotein Auswirkungen zu analysieren oder zu onside Protein Überdosierung, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für studieren ergänzen Protein-Studien in der Mais-Ernte-System. Dieses Werk enthält eine genaue Protokoll über wie einen Trojanisches Pferd Stamm, gefolgt von standardisierten Infektion Protokolle dieser Methode zu drei verschiedenen Mais Gewebetypen zu generieren.
Introduction
Der biotrophe Erreger Ustilago Maydis ist der Erreger der Mais Smut Krankheit1. Er infiziert alle oberirdischen Teile von Mais, was zu großen Tumoren, die Melanized, schwarze Sporen enthalten. Auf globaler Ebene dürfte U. Maydis verursachen einen jährlichen Verlust von rund 2 % des Mais Ertrag, während Tumoren als in Mexiko eine gastronomische Delikatesse geschätzt werden. Pflanze-Infektion wird durch eine Appressorium eingeleitet, die Zellwand Lysiereinrichtung Enzyme, die erste Schicht von Mais epidermalen Zellen durchdringen sondert. Von einer Primärinfektion Site U. Maydis wächst intrazellulär und intercellularly, ein bis zwei Zellen eindringen “layers” jeden Tag1,2. Erfolgreiche Infektion Ergebnisse im Werk Hypertrophie, die verwandelt sich in sichtbaren Tumoren auf fünf Tage post Infektion1,3,4. In allen Phasen der Infektion Biomembran pilzliche Hyphen die Pflanze Zytoplasma-Membran ohne direkten Kontakt zum Host Zytoplasma1,2. Der enge Apoplasmic Raum zwischen den infizierenden Hyphen und der Plasmamembran Pflanze gilt als der Host/Erreger interaktive Website mit dem Namen der biotrophe Wechselwirkungszone. Um das angeborene Immunsystem der Pflanze zu überwinden, sondert U. Maydis ein Array von Effektor-Proteine in der biotrophe Interaktion Zone1. Einige Effektoren sind von Pflanzenzellen aufgenommen, während andere in der biotrophe Interaktion Zone5,6,7,8bleiben. Ein Apoplasten Effektor ist UmPit2, die Interaktion mit Apoplasten Mais Proteasen die Freisetzung der Signalisierung Peptid ZmZIP1 aus ZmPROZIP durch Apoplasten Protease-Aktivität9,10zu verhindern.
In den letzten Jahrzehnten U. Maydis wurde nicht nur ein Modell für pilzartige Genetik in Pflanze-Pathogen Interaktion, sondern auch ein wertvolles Instrument in der Biotechnologie aufgrund einer wohlverstandenen Lebenszyklus, genetische Erreichbarkeit und heterologen Expression von abgesondert Proteine11,12,13. Signale für sowohl konventionelle und unkonventionelle Protein Sekretion wurden ermöglicht die Kontrolle der posttranslationale Modifikationen14ermittelt. Vor kurzem, war wie ein Trojanisches Pferd-Werkzeug, um kleine, studieren abgesondert Mais Proteine in Situ15 U. Maydis eingesetzt. Trojanisches Pferd Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um die Funktion des kleinen, sekretierten Proteins ZmMAC1 zu analysieren, die in der Anthere Entwicklung beteiligt ist. ZmMAC1 induziert die periclinal Division von pluripotenten Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation der neugebildeten Zellen15. Nach der gleichen Methode wurde die biologische Funktion des Mais Schäden verbundenen Peptids ZmZIP1 offenbart. U. Maydis sezernierenden Mais führte zu ZmZIP1 beeinträchtigt Tumor Bildung10. So, das Trojanische Pferd Ansatz stellt eine wertvolle alternative Route zur Protein in Situ Untersuchungen mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung, der auch nicht erfordern Generation von stabilen Mais Transformation Linien noch Gewebe Infiltration mit heterologously ausgedrückt und gereinigten Proteinen. Die Trojanische Pferd-Strategie ermöglicht insbesondere die Sekretion von jedem heterologen Protein in den Mais Apoplasten und direkter Vergleich von infizierten im Vergleich zu nicht-infizierten Pflanzenzellen innerhalb der gleichen Gewebe.
Dieses Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung einer U. Maydis Trojanisches Pferd Belastung um ein Protein des Interesses zu studieren. Es enthält weitere präzise Informationen über Infektion Verfahren von drei verschiedenen Mais Gewebetypen (Erwachsene Blätter, Quasten und Ohren) mit U. Maydis, eine Voraussetzung für das Studium der raumzeitlichen Infektion Fortschreiten und Protein-Funktion in diesen Zielgewebe. Keine weiteren Spezifikationen sind auf Mais gen-Amplifikation und mikroskopische bildgebende Verfahren, da diese Schritte gezielt und Instrument-abhängig sind. Somit ist dieses Protokoll an erfahrene Anwender von standard molekularbiologische Techniken gerichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moderne Pflanzenforschung erfordert Protokolle für molekulare Analyse auf genetische und Proteingehalt. Genetischen Zugänglichkeit über Transformation ist nicht verfügbar oder ineffizient und zeitaufwendig für die meisten Kulturarten wie Mais. Darüber hinaus sind zuverlässige genetische Tools wie Veranstalter Reporter Systeme rar, das macht es schwierig, in-situ Proteinfunktion raumzeitlichen hochauflösend an unterschiedliche Gewebe Standorten zu studieren. Apoplasten Proteine können durch Infiltration …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella und Armin Hildebrand danken für die Bereitstellung von Raum und Pflanze Labormaterial. Das ursprüngliche Werk über die Trojaner-Methode wurde von einer Leopoldina postdoc Fellowship und NSF Projekt IOS13-39229 unterstützt. Die in diesem Artikel vorgestellte Arbeit wurde von SFB924 (Projekte A14 und B14) der DFG unterstützt.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
