Summary

Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Este trabalho descreve a clonagem de uma estirpe de cavalo de Troia de Ustilago maydis para a entrega no local das proteínas secretadas de milho em três tipos diferentes de tecidos de milho.

Abstract

Inspirado pelo mito de cavalo de Troia Homer´s, nós produzimos o patógeno milho, Ustilago maydis entregar proteínas secretadas para o apoplasto milho permitindo análise fenotípica em vivo. Este método não se baseia na transformação de milho mas explora recursos secretoras de patógenos e genética microbiana. Neste documento, permite a inspeção de in vivo entregue proteínas secretadas com alta resolução spatiotemporal em diferentes tipos de tecidos e infecção sites. A estratégia do cavalo de Troia pode ser utilizada para complementar transitoriamente milho fenótipos de perda-de-função, caracterizar funcionalmente os domínios da proteína, para analisar os efeitos da proteína alvo, ou estudar a sobredosagem de proteína em jogo, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de proteína no sistema de colheita de milho. Este trabalho contém um protocolo preciso sobre como gerar uma cepa de cavalo de Troia, seguida de protocolos padronizados de infecção para aplicar esse método para três tipos de tecido diferentes de milho.

Introduction

O patógeno biotrófica Ustilago maydis é o agente causador da doença obscenidade milho1. Ele infecta todas as partes aéreas de milho, resultando em tumores grandes que contêm esporos melanized, preto. A nível global, U. maydis é estimado para causar uma perda anual de cerca de 2% do rendimento do milho, enquanto tumores são apreciados como uma iguaria gastronômica no México. Infecção da planta é iniciada por um apressório que secreta enzimas de lise de parede celular para penetrar a primeira camada de células epidérmicas de milho. De um local de infecção primária, U. maydis cresce intracelular e intercellularly, invadindo a célula de uma a duas camadas cada dia1,2. Resultados de infecção bem sucedida na hipertrofia da planta que se transforma em tumores visíveis após cinco dias pós infecção1,3,4. Durante todas as fases da infecção, hifas fúngicas invaginate da membrana do citoplasma de planta sem qualquer contacto directo para o anfitrião citoplasma1,2. O espaço de apoplasmic apertado entre as hifas infectante e a membrana plasmática de planta é considerado a hospedeiro/agente patogénico interativas do site, chamada de zona de interação biotrófica. A fim de superar o sistema imune inato de planta, U. maydis segrega uma matriz de proteínas efetoras para a interação biotrófica zona1. Alguns efetores são ocupados por células vegetais, enquanto os outros permanecem no biotrófica interação zona5,6,7,8. Um efetor apoplástica é UmPit2, que interage com proteases apoplástica milho para impedir a libertação da sinalização do peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplástica protease atividade9,10.

Nas últimas décadas, U. maydis tornou-se não apenas um modelo para a genética de fungosas na interação planta-patógeno, mas também uma ferramenta valiosa na biotecnologia devido a um ciclo de vida bem compreendida, fácil acessibilidade genética e expressão heteróloga de secretado proteínas11,12,13. Foram determinados sinais para ambos secreção de proteína convencional e não convencional que permite o controle de modificações do posttranslational14. Recentemente, U. maydis foi empregado como uma ferramenta de cavalo de Troia para estudar pequeno, secretada milho proteínas em situ15. A abordagem de cavalo de Troia foi usada com sucesso para analisar a função da proteína secretada, pequena ZmMAC1 que está envolvido no desenvolvimento da antera. ZmMAC1 induz a divisão periclinal de células pluripotentes e especificação de destino célula do recém-formado células15. Pelo mesmo método, a função biológica do milho associada a danos peptide ZmZIP1 foi revelada. U. maydis segregar o milho que zmzip1 resultou na deficiente formação de tumor10. Assim, o cavalo de Troia abordagem representa uma valiosa rota alternativa à proteína em situ estudos com alta resolução spatiotemporal que faz nem exigem geração de linhas de transformação de milho estável nem infiltração de tecido com heterologously proteínas expressas e purificadas. Em particular, a estratégia do cavalo de Troia permite a secreção de qualquer proteína heteróloga para o apoplasto milho e comparação direta de infectados contra células não infectadas planta dentro do mesmo tecido.

Este protocolo ilustra as principais etapas para a geração de uma estirpe de cavalo de Troia U. maydis para estudar uma proteína de interesse. Além disso inclui informações precisas sobre os procedimentos de infecção de três tipos de tecido diferentes de milho (folhas adultas, borlas e orelhas) com U. maydis, que é um pré-requisito para estudar a função de progressão e proteína de infecção spatiotemporal nestes tecidos alvo. Sem mais especificações são determinado na amplificação de gene milho e microscópicas de imagens técnicas, uma vez que estas etapas são alvo específico e dependente do instrumento. Assim, o presente protocolo é dirigido aos usuários experientes de técnicas padrão de biologia molecular.

Protocol

1. construção de um cavalo de Troia maydis U. Nota: Veja a Figura 1. Amplifica um gene de interesse do milho do cDNA usando as primeiras demão gene-específico e uma correcção DNA polimerase. Clonar o principal produto do PCR e transformar a construção em Escherichia coli , seguindo as instruções do fornecedor do plasmídeo. Verifique se o gene correto da sequência de interesse pelo prior de sequencia…

Representative Results

Construções para experimentos de cavalo de Troia U. maydis são clonadas em plasmídeo p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene de interesse-mCherry-Ha. O milho gene de interesse é fundido a uma repórter de fluorescência de mCherry e um epítopo HA-marca. A expressão da proteína de fusão está sob controle dopit2 U. maydis Um promotor que é especificamente ativa…

Discussion

Pesquisa de cultura moderna exige protocolos de análise molecular, a genética e os níveis de proteína. Genética de acessibilidade através de transformação não é disponível ou ineficiente e demorado para a maioria das espécies de culturas como o milho. Além disso, ferramentas genéticas confiáveis tais como sistemas de repórter do promotor são escassas, o que torna difícil para o estudo da função das proteínas in situ com alta resolução spatiotemporal nos sítios de tecidos distintos. Apopl?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand para fornecer material de espaço e a planta do laboratório. O trabalho original sobre o método de cavalo de Troia foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de Leopoldina e projeto NSF IOS13-39229. O trabalho apresentado neste artigo foi apoiado por SFB924 (projetos A14 e B14) da DFG.

Materials

2 mL syringe  B. Braun 4606027V
23G x 1 1/4 hypodermic needle B. Braun 4657640
Bacto Peptone  BD 211677
cDNA from maize from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal Sigma-Aldrich 05105
Confocal laser scanning microscope use locally available equipment
Cuvette (10 x 4 x 45 mm) Sarstedt 67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification use locally available equipment
Nco I NEB R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1mCherry-Ha please contact the corresponding author 
Pasteur pipet (glass, long tip) VWR 14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO Thermo Fisher Scientific K280002 can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar  VWR 90000-745
Sharpie pen use locally available equipment
Spectrophotometer use locally available equipment
Ssp I NEB R0132
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
T4 DNA ligase NEB M0202
TRIS Sigma-Aldrich TRIS-RO
Xba I NEB R0145
Yeast extract  BD 212750

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Cite This Article
Fiedler, I., Weiberg, A., van der Linde, K. Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins. J. Vis. Exp. (144), e58746, doi:10.3791/58746 (2019).

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