בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים
Summary
עבודה זו מתארת את שכפול של זן סוס טרויאני פחמון זקן התירס למסירה באתרו של חלבונים תירס מופרשים לתוך שלושה סוגים שונים של רקמות תירס.
Abstract
בהשראת המיתוס סוס טרויאני Homer´s, מתוכנן לנו את הפתוגן תירס פחמון זקן התירס כדי לספק חלבונים מופרשים לתוך אפופלסט תירס יאפשר ניתוח פנוטיפי ויוו. בשיטה זו אין להסתמך על טרנספורמציה תירס, אבל מנצלת גנטיקה של חיידקים ויכולות הפרשה של פתוגנים. במסמך זה, היא מאפשרת בדיקה של ויוו נמסר חלבונים מופרשים עם רזולוציה גבוהה ייתכן-סוגים שונים של אתרים זיהום ורקמות. האסטרטגיה סוס טרויאני יכול להיות מנוצל כדי להשלים transiently תירס פנוטיפים אובדן-של-פונקציה, לאפיין באופן פונקציונלי חלבון תחומים, כדי לנתח את המטרה חלבון אפקטים, או ללמוד כמויות חלבון onside יתר, מה שהופך אותו כלי רב עוצמה עבור מחקרים חלבון במערכת חיתוך תירס. עבודה זו מכיל פרוטוקול מדויק על איך ליצור זן סוס טרויאני ואחריו זיהום מתוקננת פרוטוקולים ליישם שיטה זו שלושה סוגי רקמות תירס שונים.
Introduction
המחלה biotrophic פחמון זקן התירס הוא סוכן סיבתי של המחלה הזימה תירס1. הוא מדביק כל החלקים אווירי של תירס וכתוצאה מכך גידולים גדולים שמכילים נבגים melanized, שחור. ברמה הגלובלית, זקן התירס בארצות הברית מעריכים כי לגרום אובדן שנתי של 2% תשואה תירס, בעוד גידולים מוערכים כמו למעדן גסטרונומי במקסיקו. צמח זיהום הוא שיזם appressorium מפריש אנזימים lysing דופן התא לחדור את השכבה הראשונה של תאים אפידרמיס תירס. מאתר זיהום ראשי, U. זקן התירס גדל intracellularly, intercellularly, פולשים תא אחד או שניים שכבות כל יום1,2. התוצאות זיהום מוצלחת בהיפרטרופיה צמח זה הופך גלוי גידולים על חמישה ימים פוסט זיהום-1,–3,–4. לאורך כל שלבי הזיהום, הפטריה invaginate קרום הציטופלסמה הצמח ללא מגע ישיר ל-1,הציטופלסמה מארח2. הרווח apoplasmic הדוקה בין hyphae המזהם את קרום פלזמה הצמח נחשב האתר המארח/פתוגן אינטראקטיבי, נקרא האזור האינטראקציה biotrophic. כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת צמח, זקן התירס בארצות הברית מפריש מערך של חלבונים אפקטור לתוך אזור האינטראקציה biotrophic1. כמה effectors נתפסות על ידי תאי צמחים, ואילו אחרים נשארים biotrophic אינטראקציה אזור5,6,7,8. אפקטור apoplastic אחד הוא UmPit2, אשר מקיים אינטראקציה עם apoplastic תירס פרוטאזות למניעת המהדורה של ה-פפטיד ZmZIP1 מ- ZmPROZIP על ידי apoplastic פרוטאז פעילות9,איתות10.
בעשורים האחרונים, זקן התירס בארצות הברית נעשו לא רק למודל גנטיקה פטרייתי באינטראקציה צמח-פתוגן, אלא גם כלי חשוב בתחום הביוטכנולוגיה עקב מחזור חיים מובנות, נגישות קלה גנטית והוא מופרש heterologous ביטוי חלבונים11,12,13. אותות עבור שניהם הפרשת חלבון קונבנציונאלי ובלתי קונבנציונאלי שנקבע המאפשר השליטה של שינויים posttranslational14. לאחרונה, זקן התירס בארצות הברית היה מועסק כלי סוס טרויאני ללמוד קטן, מופרש חלבונים תירס באתרו15. הגישה סוס טרויאני שימש בהצלחה כדי לנתח את תפקוד החלבון קטן, המופרש ZmMAC1 המעורב בפיתוח בצרכן. ZmMAC1 גורם חלוקת תאים pluripotent מפרט הגורל התא של תאי שהוקם15periclinal. באותה שיטה, תפקוד ביולוגי תירס נזק-הקשורים פפטיד ZmZIP1 נחשף. זקן התירס בארצות הברית מפריש את תירס ש-zmzip1, גרמו נפגעת היווצרות הגידול10. לפיכך, מייצג גישה סוס טרויאני מסלול חלופי בעל ערך חלבון במחקרים באתרו עם רזולוציה גבוהה ייתכן שעושה גם דורשים דור של קווים טרנספורמציה תירס יציב ולא חדירה לרקמות עם heterologously ביטוי וטיהר חלבונים. בפרט, האסטרטגיה סוס טרויאני מאפשר ההפרשה של כל חלבון heterologous לתוך אפופלסט תירס השוואה ישירה של נגועים לעומת צמח לבריא תאים בתוך הרקמה זהה.
פרוטוקול זה ממחיש את השלבים העיקריים ליצירת זן סוס טרויאני זקן התירס בארצות הברית ללמוד חלבון עניין. כוללת מידע מדויק על נוהלי זיהום של שלושה סוגים של רקמות תירס שונים (עלים בוגרים, גדילים, האוזניים) עם זקן התירס בארצות הברית, אשר הינה תנאי לימוד הפונקציה התקדמות, חלבון ייתכן זיהום ברקמות המטרה אלה. לא מפרטים נוספים הינם נתון על תירס גנטי הגברה מיקרוסקופיים הדמיה טכניקות, מאז השלבים במטרה הינם תלויי-כלי נגינה. לפיכך, פרוטוקול זה מיועד למשתמשים מנוסים של ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי טכניקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיתוך מודרני מחקר דורשת פרוטוקולים עבור ניתוח מולקולרית על גנטי ורמות החלבון. נגישות גנטי באמצעות טרנספורמציה אינה זמינה או לא יעיל ולגזול עבור רוב היבול מינים כגון תירס. יתר על כן, כלי אמין גנטיות כגון מערכות כתב יזם הם נדירים, מה שהופך את זה קשה ללמוד באתרו וחלבון לתפקד עם רזולוציה ג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות דרסלהאוס תומאס, מרטין Parniske, אופיר לא משנה Djella וארמין הילדברנד למתן שטח מעבדה וחומר צמח. היצירה המקורית על שיטת סוס טרויאני נתמכה על-ידי מלגת פוסט דוקטורט Leopoldina אכ מ פרויקט IOS13-39229. העבודה שהוצגו במאמר זה נתמך על ידי SFB924 (פרויקטים A14 ו B14) של DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
