Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie
Summary
Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.
Abstract
Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs) van de canonieke TRP onderfamilie zijn opvangfaciliteiten catie kanalen die een essentiële rol bij de calcium-homeostase, met name op de winkel bediende calcium ingang, die is van cruciaal belang spelen voor het behoud van de goede werking van Synaptic vesikel release en intracellulaire signaalroutes. Dienovereenkomstig, TRPC kanalen zijn betrokken in een verscheidenheid van ziekten bij de mens met inbegrip van cardiovasculaire aandoeningen zoals hypertrofie van het hart, neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson en neurologische aandoeningen zoals spinocerebellar ataxie. Daarom, TRPC kanalen vertegenwoordigen een potentieel farmacologische doelwit in ziekten bij de mens. De moleculaire mechanismen van het gating in deze kanalen zijn echter nog onduidelijk. De moeilijkheid in het verkrijgen van grote hoeveelheden van stabiele, homogene en gezuiverde proteïne is een beperkende factor in structuur vastberadenheid studies, met name voor zoogdieren membraaneiwitten zoals de ionenkanalen TRPC geweest. Hier presenteren we een protocol voor de grootschalige uitdrukking van zoogdieren ion kanaal membraaneiwitten met behulp van een gemodificeerde baculovirus systeem voor de overdracht van de genen en de zuivering van deze proteïnen door affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie. Verder presenteren we een protocol voor het verzamelen van single-deeltje cryo-Elektron microscopie beelden van gezuiverde eiwit en deze om beelden te gebruiken om te bepalen van de eiwitstructuur. Structuurbepaling is een krachtige methode voor het begrijpen van de mechanismen van gating en functie in ionenkanalen.
Introduction
Calcium is betrokken bij de meest cellulaire processen, waaronder signalering cascades, transcriptie controle, neurotransmitter release en hormoon molecuul synthese1,2,3. De homeostatische onderhoud van cytosolische vrij calcium is essentieel voor de gezondheid en functie van cellen. Een van de belangrijkste mechanismen van intracellulair calcium-homeostase is calcium winkel bediende ingang (SOCE), een proces waarin uitputting van calcium in het endoplasmatisch reticulum (ER) triggers de opening van de ionenkanalen op het plasma-membraan opgeslagen te vergemakkelijken de aanvulling ER calcium, die vervolgens kunnen worden gebruikt in de verdere signalering4,5,6. Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs), die calcium-permeabele kanalen die behoren tot de superfamilie TRP, hebben geïdentificeerd als een belangrijke deelnemer in SOCE7,8,9 .
Onder de zeven leden in de familie van de TRPC, TRPC3, TRPC6 en TRPC7 vormen een deelgroep van de homologe en ze zijn uniek in de mogelijkheid om te worden geactiveerd door de lipide secundaire messenger diacylglycerol (DAG), een afbraakproduct van de Lipide signalering phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2)10,11. TRPC3 is sterk uitgedrukt in gladde spieren en in de cerebrale en cerebellaire gebieden van de hersenen, waar het essentiële rol in het calcium signalering die van invloed zijn transmissie en neurogenese12,13speelt. Dysfunctie van TRPC3 is gekoppeld aan het centrale zenuwstelsel-stoornissen, cardiovasculaire aandoeningen en bepaalde kankers zoals ovariële adenocarcinoom14,15,16. Daarom, TRPC3 houdt belofte als farmaceutische doel voor de behandeling van deze ziekten. De ontwikkeling van gerichte geneesmiddelen op TRPC3 heeft is beperkt door een gebrek aan begrip van de activering van de moleculaire mechanismen, met inbegrip van lipide bindende sites17,18. Biedt belangrijke inzichten in deze mechanismen19, hebben we de eerste atomaire resolutie structuur van het menselijke TRPC3 kanaal (hTRPC3) en haar twee lipide bandplaatsen in een gesloten toestand, gemeld.
De belangrijkste factor voor het bepalen van de structuur van een membraan eiwit op hoge resolutie is voor eiwitten van hoge kwaliteit. De overeenkomstige screening van expressie en zuivering voorwaarden tot het verkrijgen van hoge kwaliteit proteïne kan een tijdrovende en dure inspanning. Hier presenteren we een protocol beschrijft in detail hoe wij de optimale omstandigheden voor de expressie en de zuivering van hTRPC3, die zich slecht in onze eerste screening gedragen te identificeren. Wij presenteren verschillende belangrijke punten over het oplossen en optimaliseren van het gedrag van de eiwitten, die een solide basis voor onze cryo-Elektron microscopie (cryo-EM) studies leggen. We gebruiken een gemodificeerde baculoviral vector (pEG), ontwikkeld door Gouaux en collega’s, dat is geoptimaliseerd voor screening tests en efficiënte generatie baculovirus in zoogdiercellen20genereren. Deze expressie-methode is geschikt voor snelle en kostenefficiënte overexpressie van eiwitten in de celmembraan van zoogdieren. Wij combineren het gebruik van deze vector met een fluorescentie-detectie grootte-uitsluiting chromatografie-gebaseerde (FSEC) methode21prescreening. Deze methode maakt gebruik van een tag van de groen fluorescente proteïne (GFP) gefuseerd tot de constructie van belang en verbetert de visualisatie van de doel-proteïne in kleine, hele-cel ontbindend monsters. Dit zorgt voor screening van eiwitstabiliteit in aanwezigheid van verschillende detergentia en additieven, met thermostabilizing mutaties, en maakt het gebruik van een klein aantal cellen uit kleinschalige voorbijgaande transfectie. Op deze manier kan een veelheid van voorwaarden snel worden gescreend alvorens tot een grootschalige eiwitreiniging. Naar aanleiding van meningsuiting, screening en zuivering presenteren we een protocol voor het verkrijgen en verwerken van beelden uit cryo-EM voor het genereren van een DOVO structurele bepaling van het eiwit. Wij zijn van mening dat de hier beschreven aanpak als een gegeneraliseerd protocol voor structurele studies van TRP kanaal receptoren en andere membraaneiwitten dienen zal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Structurele bepaling van eiwitten door cryo-EM heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van structurele biologie in de afgelopen jaren, dankzij de ontwikkeling van nieuwe camera’s en algoritmen waarmee u aanzienlijk sneller kunt de structuurbepaling van proteïnen toe die niet gemakkelijk crystalize, met name membraaneiwitten. Ondanks al de recente vooruitgang in de cryo-EM-techniek blijft de voorbereiding van gezuiverde eiwitten voldoende kwaliteit en kwantiteit te vergemakkelijken van hoogwaardige imaging vaak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken G. Zhao en X. Meng voor de ondersteuning bij het verzamelen van de gegevens op de David Van Andel geavanceerde Cryo-Elektron microscopie Suite. Wij waarderen de VARI High-Performance Computing team voor computationele steun. Wij geven onze dankbaarheid aan N. Clemente, D. contributie, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth en Z. Ruan voor opmerkingen die sterk verbeterd dit manuscript. Wij danken D. Nadziejka voor redactionele ondersteuning voor dit manuscript. Dit werk werd gesteund door interne VARI financiering.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
