İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık
Summary
Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.
Abstract
Geçici reseptör potansiyeli kanal (TRPCs) kurallı TRP Alt familya kalsiyum homeostazı, uygun fonksiyonu korumak açısından çok önemlidir özellikle mağaza işletilen kalsiyum giriş önemli bir rol oynamaktadır nonselective katyon kanalları vardır sinaptik vezikül yayın ve hücre içi sinyal yollar. Buna göre TRPC kanalları insan hastalıkları kalp hipertrofisi gibi kardiyovasküler bozuklukları, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkları ve spinocerebellar ataksi gibi nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli karıştığı olmuştur. Bu nedenle, TRPC kanalları insan hastalıkları bir potansiyel farmakolojik hedefini temsil eder. Ancak, bu kanallar perdeleme moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. İstikrarlı, homojen ve saf protein bol miktarda almak üzere zorluk yapı belirlenmesi çalışmaları, özellikle TRPC iyon kanalları gibi memeli membran proteinlerinin için kısıtlayıcı bir faktör olmuştur. Burada, memeli iyon kanal membran proteinlerinin değiştirilmiş baculovirus Gen aktarım sistemi ve bu proteinlerin saflaştırılması kullanarak benzeşme ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından büyük ölçekli bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Biz daha da saf protein tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu görüntüleri toplamaya ve protein yapısı belirlemek için bu görüntüleri kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yapı belirlenmesi çoğunluğuna ve iyon kanalları işlevinde mekanizmaları anlamak için güçlü bir yöntemdir.
Introduction
Kalsiyum cascades, transkripsiyon kontrolü, nörotransmitter yayın ve hormon molekül sentezi1,2,3sinyal de dahil olmak üzere en hücresel süreçler ilişkidedir. Sitozolik ücretsiz kalsiyum homeostatik bakım sağlık ve işlevi hücre için çok önemlidir. Hücre içi kalsiyum homeostazı büyük mekanizmaları biridir kalsiyum deposu ile çalışan giriş (SOCE), kalsiyum tükenmesi içeren endoplazmik retikulum (ER) Tetikleyiciler iyon kanalları açılması kolaylaştırmak için plazma membran üzerinde bir işlem daha sonra daha fazla4,5,6sinyal kullanılabilir ER kalsiyum yenilenmesi. Kalsiyum geçirgen kanalları için TRP süper ait, geçici reseptör potansiyel kanalları (TRPCs), SOCE7,8,9 büyük bir katılımcısı olarak tespit edilmiştir.
TRPC aile yedi üyeleri arasında TRPC3, TRPC6 ve TRPC7 bir homologue alt formu, onlar yetenek lipid ikincil haberci diacylglycerol tarafından (DAG), sinyal lipid bozulması ürünün etkinleştirilmesi için benzersizdir phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 son derece düz kas ve nerede12,13neurotransmission ve neurogenesis etkisi kalsiyum sinyal içinde önemli rol oynamaktadır beyin, serebral ve serebellar bölgelerinde ifade edilir. TRPC3 işlev bozukluğu merkezi sinir sistemi bozuklukları, kalp-damar hastalıkları ve bazı kanserler gibi yumurtalık adenokarsinom14,15,16bağlanmıştır. Bu nedenle, TRPC3 bu hastalıkların tedavisi için ilaç hedef olarak söz sahibidir. Özellikle hedeflenen uyuşturucu TRPC3 üzerinde hareket gelişimi lipid bağlama siteleri17,18de dahil olmak üzere onun moleküler harekete geçirmek mekanizmaları anlayış eksikliği tarafından sınırlıdır. Bu mekanizmaları19önemli anlayışlar sağlayan insan TRPC3 kanal (hTRPC3) ve onun iki lipid bağlayıcı siteleri bir kapalı durumda ilk Çözünürlük atomik yapısını bildirdin.
Yüksek çözünürlükte bir membran protein yapısını belirleyen en önemli unsur yüksek kaliteli protein elde etmektir. İfade ve arıtma yüksek kaliteli protein elde etmek gerekli koşullar ilgili tarama zaman alıcı ve pahalı bir çaba olabilir. Burada ayrıntılı olarak nasıl ifade ve kötü davrandım bizim başlangıç tarama hTRPC3 arınma için en uygun koşulları tanımlamak açıklayan bir iletişim kuralı mevcut. Biz sağlam bir temel için bizim cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) çalışmalar yatıyordu protein davranış en iyi duruma getirme ve sorun giderme hakkında birkaç anahtar nokta mevcut. Deneyleri ve verimli baculovirus memeli hücreleri20nesil tarama için en iyi duruma getirilmiş Gouaux ve meslektaşları, tarafından geliştirilen vektör (pEG), üreten bir değiştirilmiş baculoviral kullanıyoruz. Bu ifade Yöntem hızlı ve düşük maliyetli overexpression proteinlerin memeli hücre zarı için uygundur. Biz yöntemi21prescreening kullanımı ile bir floresan-algılama boyutu-dışlama Kromatografi tabanlı bu vektör (FSEC) birleştirmek. Bu yöntem faiz yapısı için erimiş bir yeşil flüoresan protein (GFP) etiketini kullanır ve küçük, tüm hücreli çözündürüldükten örneklerinde hedef proteinin görselleştirme geliştirir. Bu farklı deterjanlar ve katkı maddeleri ile thermostabilizing mutasyonlar, protein istikrar testi ile taranması için izin verir ve küçük ölçekli geçici transfection hücrelerden az sayıda kullanımına izin verir. Bu şekilde, koşullar çok sayıda hızla bir büyük ölçekli protein saflaştırma taşımadan önce taramaya tabi. İfade, filtreleme ve arıtma biz elde etmek ve bir de novo yapısal kararlılık protein oluşturmak için cryo-EM görüntüleri işlemek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut. Biz burada açıklanan yaklaşımlar için TRP kanal reseptörleri ve diğer membran proteinlerinin yapısal çalışmaların genelleştirilebilir bir iletişim kuralı işlevi görecek inanıyorum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yapısal proteinler cryo-EM tarafından belirlenmesi önemli ölçüde hızlandırır kadar değil protein yapısı belirlenmesi yeni kameralar ve algoritmaları geliştirilmesi sayesinde son birkaç yıl içinde yapısal biyoloji alanında devrim yarattı kolayca kristal, özellikle membran proteinlerinin. Tüm cryo-EM tekniği son gelişmeler rağmen yüksek kaliteli kez Imaging kolaylaştırmak için hazırlık saf protein kalite ve miktar yeterli zaman alıcı, masraflı ve zorlu kalır. Hızlı bir şekilde ifade et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz G. Zhao ve X. Meng desteği ile David Van Andel Advanced Cryo-elektron mikroskobu Suite, veri toplama için teşekkür ederiz. VARI yüksek performanslı bilgi işlem takım Hesaplamalı destek için teşekkür ederiz. Bu el yazması büyük ölçüde geliştirilmiş Yorumlar için minnettarlığımızı i. Clemente, ö. aidat, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth ve Z. Ruan ver. Biz ö Nadziejka bu el yazması için editoryal destek için teşekkür ederiz. Bu eser iç VARI tarafından desteklenen fon.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
