Summary

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Abstract

Transiente do receptor potencial canais (TRPCs) da subfamília TRP canônica são canais de cátion não seletivo que desempenham um papel essencial na homeostase do cálcio, entrada de cálcio particularmente operada a loja, que é fundamental para manter a função adequada de lançamento da vesícula sináptica e vias de sinalização intracelulares. Por conseguinte, canais TRPC têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares, tais como hipertrofia cardíaca, doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e distúrbios neurológicos como ataxia espinocerebelar. Portanto, canais TRPC representam um potencial alvo farmacológico em doenças humanas. No entanto, os mecanismos moleculares de gating nesses canais são ainda pouco claras. A dificuldade na obtenção de grandes quantidades de proteína purificada, homogênea e estável tem sido um fator limitante em estudos de determinação de estrutura, particularmente para proteínas de membrana de mamíferos como os canais de íon TRPC. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão em larga escala de proteínas de membrana de canal íon mamíferos usando um sistema de transferência do gene de baculovirus modificados e a purificação destas proteínas por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. Apresentamos mais um protocolo para coletar imagens de microscopia cryo-elétron da único-partícula de proteína purificada e usar estas imagens para determinar a estrutura da proteína. Determinação da estrutura é um método poderoso para compreender os mecanismos de retenção e função em canais iônicos.

Introduction

Cálcio está envolvido em processos mais celulares, incluindo a sinalização, cascatas, controle de transcrição, liberação de neurotransmissor e hormônio molécula síntese1,2,3. A manutenção homeostática do cálcio citosólico livre é crucial para a saúde e a função das células. Um dos principais mecanismos de homeostase de cálcio intracelular é operada a loja cálcio entrada (SOCE), um processo no qual depleção de cálcio armazenado em disparadores o retículo endoplasmático (ER) a abertura de canais iônicos na membrana plasmática, para facilitar a reposição de cálcio ER, que pode ser usado na sinalização mais4,5,6. Canais potencial receptor transitória (TRPCs), que são canais de cálcio-permeável pertencentes à Superfamília TRP, identificaram-se como um participante importante em SOCE7,8,9 .

Entre os sete membros da família TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formam um subgrupo homólogo, e eles são únicos na habilidade de ser ativado pelo Mensageiro secundário lipídico diacilglicerol (DAG), um produto de degradação de lipídios a sinalização fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 é altamente expresso no músculo liso e nas regiões do cérebro, onde ele tem um papel essencial na sinalização de cálcio que afetam a neurotransmissão e neurogênese12,13cerebrais e cerebelares. Disfunção de TRPC3 tem sido associada a distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares e certos tipos de câncer como adenocarcinoma ovariano14,15,16. Portanto, TRPC3 é uma promessa como um destino de farmacêutico para o tratamento destas doenças. Desenvolvimento de fármacos direcionados especificamente atuando na TRPC3 tem sido limitado pela falta de compreensão de seus mecanismos de ativação molecular, incluindo lipídios vinculação sites17,18. Informamos a primeira estrutura atômica-resolução do canal de TRPC3 humano (hTRPC3) e os seus sítios de ligação de lipídios dois em um estado fechado, proporcionando insights importantes sobre esses mecanismos de19.

O fator chave para determinar a estrutura de uma proteína de membrana em alta resolução é obter proteína de alta qualidade. O rastreio correspondente de expressão e purificação de condições necessárias para obter a proteína de alta qualidade pode ser uma tarefa demorada e dispendiosa. Aqui nós apresentamos um protocolo descrevendo em detalhe como identificamos as condições ideais para a expressão e purificação de hTRPC3, que se comportou mal na nossa seleção inicial. Apresentamos vários pontos-chave sobre como solucionar problemas e otimizar o comportamento da proteína, que colocam uma base sólida para nossa cryo-elétron estudos de microscopia (cryo-EM). Nós usamos um baculoviral modificado gerando vetor (pEG), desenvolvido pela Gouaux e colegas, que é otimizado para a seleção de ensaios e eficiente geração de baculovirus em células de mamíferos,20. Este método de expressão é apropriado para rápida e econômica a superexpressão de proteínas na membrana celular dos mamíferos. Podemos combinar o uso deste vetor com uma tamanho de fluorescência-deteção-exclusão baseada em cromatografia (FSEC) prescreening método21. Esse método usa uma tag de proteína verde fluorescente (GFP) fundida-se para a construção de interesse e melhora a visualização da proteína alvo em amostras pequenas, células inteiras de solubilizado. Isto permite a análise de estabilidade de proteína na presença de diferentes detergentes e aditivos, com mutações thermostabilizing e permite o uso de um pequeno número de células de transfecção transiente em pequena escala. Desta forma, uma infinidade de condições pode ser rastreada rapidamente antes de se mudar para uma purificação de proteínas em larga escala. Após a triagem, expressão e purificação, apresentamos um protocolo para obtenção e processamento de imagens de cryo-EM gerar uma determinação estrutural de novo da proteína. Acreditamos que as abordagens descritas aqui vão servir como um protocolo generalizável para estudos estruturais de receptores de canal TRP e outras proteínas de membrana.

Protocol

1. transformação de células competentes de DH10α para produzir Bacmid DNA Sintetizar o gene de interesse e subclone-lo em uma versão modificada do vetor pEG contendo uma gêmeo estreptococos-marca, uma marca His8 e GFP com um local de clivagem de trombina nas N terminal (pFastBacI)20. Transformar células competentes adicionando 5 ng do plasmídeo contendo o gene desejado em pFastBacI de 50 μL de DH10α células em um 1,5 mL tubo e incubam durante 10 min no gelo. Choque d…

Representative Results

Uma visão esquemática do protocolo para a expressão e purificação de hTRPC3 são mostrados na figura 1A. Uma imagem da placa de bacmid de hTRPC3 com colônias brancas ideais, semelhantes àquele selecionado para a purificação de DNA de bacmid, é mostrada na figura 1B. Descobrimos que 48 h é ideal para coloração de Bluo-gal clara, mantendo a presença de colônias isoladas. Picos de produção de vírus de P2 para hTRPC…

Discussion

Determinação estrutural de proteínas por cryo-EM tem revolucionado o campo da biologia estrutural nos últimos anos, graças ao desenvolvimento de novas câmeras e algoritmos que acelera significativamente a determinação da estrutura das proteínas que não prontamente crystalize, particularmente as proteínas da membrana. Apesar de todos os avanços recentes na técnica de cryo-EM, a preparação de proteínas purified em qualidade e quantidade suficiente para facilitar a alta qualidade de imagem muitas vezes conti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos G. Zhao e X. Meng o apoio com coleta de dados para o David Van Andel Cryo-elétron microscopia conjunto avançado. Agradecemos a equipe VARI de computação de alto desempenho para suporte computacional. Nós damos nossa gratidão a s. Clemente, D. dívidas, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z para comentários que melhoraram muito este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoio editorial para este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela VARI interno financiamento.

Materials

pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent – to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

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Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

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