Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия
Summary
Этот протокол описывает методы, используемые для определения структуры ионного канала крио электронная микроскопия, включая систему бакуловирусы используется эффективно выражать гены в клетках млекопитающих с минимальными усилиями и токсичности, экстракции белков, очистка, и проверка качества, сетка пробоподготовки и скрининга, а также сбор и обработка данных.
Abstract
Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs) канонических подсемейство ГТО, неселективных катиона каналы, которые играют важную роль в гомеостаз кальция, кальция, особенно магазин работает запись, которая имеет решающее значение для поддержания надлежащего функционирования релиз синаптических пузырьков и внутриклеточных сигнальных путей. Соответственно Термизатор каналы были вовлечены в различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистых расстройств, таких как гипертрофии сердца, нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона и неврологических расстройств, таких как Спиноцеребеллярная атаксия. Таким образом Термизатор каналы представляют потенциальной мишенью фармакологических в заболеваниях человека. Однако молекулярные механизмы стробирования в эти каналы по-прежнему неясны. Трудности в получении большого количества стабильной, однородной и очищенный белок был ограничивающим фактором в исследованиях определение структуры, особенно для млекопитающих мембранных белков например Термизатор ионных каналов. Здесь мы представляем собой протокол для крупномасштабных выражение млекопитающих ионного канала мембранных белков с помощью очистки этих белков и системы передачи гена модифицированных бакуловирусы сродства и размер-гель-проникающей хроматографии. Далее мы представляем протокол для сбора сингл частица крио электронная микроскопия изображения от очищенный протеин и использовать эти изображения для определения структуры белков. Для определения структуры это мощный метод для понимания механизмов, стробирование и функции в ионных каналов.
Introduction
Кальций участвует в самых клеточных процессах, включая сигнальные каскады, транскрипция управления, нейромедиатора релиз и гормон молекулы синтез1,2,3. Гомеостатических поддержание цитозольной свободного кальция имеет решающее значение для здоровья и функции клеток. Одним из основных механизмов гомеостаза внутриклеточного кальция является запись работает магазин кальция (SOCE), процесс, в котором истощения кальция хранится в эндоплазматический ретикулум (ER) триггеры открытие ионных каналов на плазматической мембраны для облегчения пополнение ER кальция, который затем может использоваться в дальнейшей сигнализации4,5,6. Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs), которые кальция проницаемые каналы, принадлежащие ГТО надсемейства, были определены как одним из основных участников в SOCE7,8,9 .
Среди семи членов в семье Термизатор TRPC3, TRPC6 и TRPC7 образуют подгруппу гомолог, и они являются уникальными в способности быть активированы липидов вторичных посланник диацилглицерол (ГПДР), продуктом разложения сигналов липидов фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (PIP2)10,11. Высоко TRPC3 выражается в гладких мышц и регионах мозга и мозжечка головного мозга, где он играет существенную роль в сигнализации кальция, которые влияют синапсах и нейрогенез12,13. Дисфункция TRPC3 были связаны с центральной нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний и некоторых видов рака, таких как аденокарцинома яичников14,,1516. Таким образом TRPC3 обещает как фармацевтического назначения для лечения этих заболеваний. Разработка целенаправленных препараты, действующие на TRPC3 было ограничено отсутствием понимания его молекулярной активации механизмов, включая липидов привязки сайтов17,18. Мы сообщили первой атомной резолюции структуры человеческого TRPC3 канал (hTRPC3) и ее две липидов привязки сайтов в закрытом состоянии, предоставляя важные выводы этих механизмов19.
Ключевым фактором для определения структуры мембранный белок с высоким разрешением, чтобы получить белка высокого качества. Соответствующие скрининг очистки и выражение условия, необходимые для получения высококачественного белка может быть длительным и дорогостоящим стремиться. Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий, как мы определить оптимальные условия для выражения и очистки hTRPC3, который вел себя плохо в наших первоначальных скрининг. Мы представляем несколько ключевых моментов, о том, как оптимизировать поведение белка, который заложить прочную основу для нашей крио электронная микроскопия (крио ЭМ) исследования и устранения неполадок. Мы используем модифицированных baculoviral генерации вектор (ПЭГ), разработанный Gouaux и коллеги, который оптимизирован для скрининговых анализов и эффективного поколения бакуловирусы в mammalian клетках20. Это выражение метод подходит для быстрого и экономически гиперэкспрессия белков в млекопитающих клеточной мембраны. Мы совмещаем использование данного вектора с флуоресцентным обнаружением размер исключение на основе хроматографии (FSEC), подавшим метод21. Этот метод использует тег Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), сливается с конструкцией интерес и улучшает визуализацию целевого белка в небольших, поклеточного растворимых образцов. Это позволяет для проверки стабильности белка в присутствии различных моющих средств и добавок, с thermostabilizing мутации и позволяет использовать небольшое количество клеток от небольших переходных transfection. Таким образом множество условий может проверяться быстро до переезда в крупномасштабных белка очистки. После выражения, скрининг и очистки мы представляем собой протокол для получения и обработки изображений с крио EM для создания de novo определение структурного белка. Мы считаем, что подходы, описанные здесь будет служить обобщаемым протокол для структурных исследований ГТО канал рецепторов и других мембранных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Структурные определения белков, крио EM произвела революцию в области структурной биологии в последние несколько лет, благодаря разработке алгоритмов и новых камер, что значительно ускоряет определение структуры белков, которые не легко crystalize, особенно мембранных белков. Несмотря на в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим G. Чжао и X. Meng за поддержку в сборе данных в Дэвид Ван Андел Advanced крио-электронная микроскопия Suite. Мы высоко ценим VARI высокопроизводительных вычислений команды для компьютерной поддержки. Мы даем нашу благодарность N. Клементе, D. взносы, J. Floramo, ю. Хуан, ю. Ким, C. Mueller, B. рот и Z. Ruan для комментариев, которые значительно улучшили эту рукопись. Мы благодарим д Nadziejka за редакционную поддержку для этой рукописи. Эта работа была поддержана внутренней VARI финансирования.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
