Summary

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.

Abstract

Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC) della sottofamiglia TRP canonica sono canali cationici non selettivi che svolgono un ruolo essenziale nell’omeostasi del calcio, voce negozio-funzionata specialmente del calcio, che è fondamentale per mantenere il corretto funzionamento del rilascio delle vescicole sinaptiche e vie di segnalazione intracellulare. Di conseguenza, canali TRPC sono stati implicati in una varietà di malattie umane, inclusi i disturbi cardiovascolari quali l’ipertrofia cardiaca, malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e disturbi neurologici come atassia spinocerebellar. Canali TRPC rappresentano quindi un potenziale bersaglio farmacologico in malattie umane. Tuttavia, i meccanismi molecolari del gating in questi canali sono ancora poco chiari. La difficoltà nell’ottenere grandi quantità di proteina purificata, omogenea e stabile è stata un fattore limitante negli studi di determinazione di struttura, particolarmente per le proteine di membrana dei mammiferi quali i canali ionici TRPC. Qui, presentiamo un protocollo per l’espressione su larga scala di proteine di membrana del canale dello ione dei mammiferi utilizzando un sistema di trasferimento del gene di baculovirus modificate e la purificazione di queste proteine di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Presentiamo inoltre un protocollo per raccogliere immagini di microscopia di singola particella cryo-elettrone dalla proteina purificata e utilizzare queste immagini per determinare la struttura della proteina. Determinazione della struttura è un metodo potente per la comprensione dei meccanismi di gating e funzione di canali ionici.

Introduction

Calcio è coinvolto nei processi più cellulari tra cui segnalazione cascades, controllo trascrizione, rilascio di neurotrasmettitori e ormoni molecola sintesi1,2,3. Il mantenimento omeostatico di calcio libero citosolico è cruciale per la salute e la funzione delle cellule. Uno dei principali meccanismi dell’omeostasi intracellulare del calcio è calcio store-operati voce (SOCE), un processo in cui lo svuotamento di calcio memorizzati nei trigger del reticolo endoplasmatico (ER) l’apertura dei canali ionici sulla membrana plasmatica per facilitare la rifornimento di calcio di ER, che può quindi essere utilizzato in ulteriore segnalazione4,5,6. Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC), che sono canali calcio-permeabile della superfamiglia di TRP, sono stati identificati come un partecipante importante SOCE7,8,9 .

Tra i sette membri della famiglia di TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formano un sottogruppo di omologo, e sono unici nella capacità di essere attivato dal lipido messaggero secondario diacilglicerolo (DAG), un prodotto di degradazione del lipido di segnalazione fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 è altamente espressa nel muscolo liscio e nelle regioni cerebrali e cerebellari del cervello, in cui svolge ruoli essenziali nella segnalazione del calcio che hanno un impatto neurotrasmissione e neurogenesi12,13. Disfunzione di TRPC3 è stata collegata a disturbi del sistema nervoso centrale, disturbi cardiovascolari e alcuni tipi di cancro come adenocarcinoma ovarico14,15,16. Pertanto, TRPC3 tiene la promessa come una destinazione farmaceutica per il trattamento di queste malattie. Lo sviluppo di farmaci specificamente mirati che agiscono sul TRPC3 è stato limitato da una mancanza di comprensione dei suoi meccanismi molecolari di attivazione, tra cui lipidica associazione siti17,18. Abbiamo segnalato la prima struttura di atomico-risoluzione del canale umano di TRPC3 (hTRPC3) e suoi siti di legame di lipido due in uno stato chiuso, fornendo importanti intuizioni questi meccanismi19.

Il fattore chiave per determinare la struttura di una proteina di membrana ad alta risoluzione è quello di ottenere proteine di alta qualità. La proiezione corrispondente espressione e purificazione condizioni necessarie per ottenere proteine di alta qualità può essere uno sforzo lungo e oneroso. Qui presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio come identificare le condizioni ottimali per l’espressione e purificazione di hTRPC3, che si è comportato male in nostro screening iniziale. Vi presentiamo alcuni punti chiave su come risolvere i problemi e ottimizzare il comportamento della proteina, che pongono una solida base per il nostro cryo-elettrone studi di microscopia (cryo-EM). Usiamo un baculovirus modificate generando vettoriale (pEG), sviluppato da Gouaux e colleghi, che è ottimizzato per lo screening di analisi e generazione efficiente di baculovirus in cellule di mammifero20. Questo metodo di espressione è appropriato per rapido ed economico iperespressione delle proteine nella membrana delle cellule dei mammiferi. Uniamo l’utilizzo di questo vettore con una rilevazione della fluorescenza esclusione basata su cromatografia (FSEC) prescreening metodo21. Questo metodo utilizza un tag di proteina fluorescente verde (GFP) fuso al costrutto di interesse e migliora la visualizzazione della proteina dell’obiettivo in piccole, cellule intere campioni solubilizzati. Questo permette per lo screening della stabilità proteica in presenza di diversi detergenti e additivi, con mutazioni di thermostabilizing e permette l’uso di un piccolo numero di cellule dalla trasfezione transiente in piccola scala. In questo modo, una moltitudine di condizioni può essere rapidamente proiettata prima di passare ad una purificazione di proteine su larga scala. A seguito di espressione, lo screening e la purificazione, presentiamo un protocollo per ottenere ed elaborare immagini da cryo-EM per generare una de novo determinazione strutturale della proteina. Noi crediamo che gli approcci descritti qui servirà come un protocollo generalizzabile per studi strutturali di recettori canale TRP e altre proteine di membrana.

Protocol

1. trasformazione delle cellule competenti di DH10α per produrre Bacmid DNA Sintetizzare il gene di interesse e subclone esso in una versione modificata del vettore pEG contenente un doppia strep-tag, un His8-tag e GFP con un sito di clivaggio della trombina al capolinea (pFastBacI) N20. Trasformare cellule competenti con l’aggiunta di 5 ng di plasmide contenente un gene desiderato in pFastBacI a 50 μL di DH10α cellule in un 1,5 mL tubo e incubare per 10 minuti in ghiaccio. …

Representative Results

Una descrizione schematica del protocollo per l’espressione e purificazione di hTRPC3 è mostrati in Figura 1A. Un’immagine della hTRPC3 bacmid piastra con colonie bianchi ideale, simile a quella selezionata per purificazione del DNA di bacmid, è mostrata in Figura 1B. Abbiamo trovato che 48 ore è ideale per la colorazione chiara Bluo-gal mantenendo la presenza di colonie isolate. Picco della produzione di virus P2 per hTRPC3, …

Discussion

Determinazione strutturale delle proteine da cryo-EM ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale negli ultimi anni, grazie allo sviluppo delle nuove telecamere e algoritmi che velocizza notevolmente la determinazione della struttura delle proteine che non prontamente cristallizzarsi, in particolare proteine di membrana. Nonostante tutti i recenti progressi nella tecnica di cryo-EM, la preparazione delle proteine purificate in qualità e quantità sufficiente per facilitare ad alta-qualità delle immagini spesso …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Si ringraziano G. Zhao e X. Meng per il supporto con raccolta di dati presso il David Van Andel Advanced Cryo-Electron microscopia Suite. Apprezziamo il team VARI High-Performance Computing per supporto computazionale. Noi diamo la nostra gratitudine a N. Clemente, D. debiti, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z per i commenti che ha notevolmente migliorato questo manoscritto. Si ringrazia D. Nadziejka per supporto editoriale per questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da interno VARI finanziamenti.

Materials

pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent – to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

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Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

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